過繼性細胞免疫療法已經從工作檯轉移到床邊，預示著血液系統惡性腫瘤治療進入一個新的、充滿希望的時代。雖然 CAR-T 細胞產品無疑改善了臨床結果並為難治性和復發性血液系統惡性腫瘤患者提供了新的希望，但自第一個 CAR-T 細胞產品上市以來近 5 年的實際臨床經驗也導致了一些清醒的認識。許多該領域的經驗。除了與自體細胞製造相關的繁瑣物流和細胞治療相關毒性的高發生率之外，最緊迫的問題仍然是長期疾病控制欠佳。正如初始關鍵試驗的最新結果所示，當前一代 CAR-T 產品仍無法為許多患者提供長期反應，很大一部分接受治療的患者最終會復發並死於疾病。
近年來，自然殺傷 (NK) 細胞的 CAR 工程獲得了相當大的關注，因為 NK 細胞的獨特生物學特性使其成為對癌症免疫治療極具吸引力的細胞。NK 細胞是先天免疫細胞，通過多種作用機制介導對癌細胞和病毒感染細胞的細胞毒性。NK對異常細胞的識別主要是由目標 MHC-I 表面表達的缺失驅動的傳統教條隨著時間的推移，通過對來自激活和抑制受體的多種刺激的複雜整合得更微妙的理解而得到擴展，這些刺激共同決定NK 細胞激活狀態和目標參與。NK細胞，即使經過基因改造以表達 CAR 分子，仍保留其通過其天然受體識別腫瘤細胞的內在能力，從而為它們提供額外的一層抗腫瘤反應性，獨立於CAR重定向殺傷。值得注意的是，NK 細胞不依賴 T 細胞受體 (TCR) 進行細胞毒性殺傷。與他們的 T 細胞競爭者相比，這使他們具有更有利的安全性，在同種異體環境中，後者需要進一步進行基因改造以規避移植物抗宿主病 (GvHD)。
構建下一代CAR-NK療法
癌細胞已經進化出複雜的免疫抑制機制來阻止浸潤淋巴細胞的作用並逃避腫瘤免疫監視。雖然早期的研究主要集中在免疫逃逸的癌症內在機制上，但人們越來越認識到免疫細胞特異性因素，這些因素支持基本表型重組，使免疫細胞處於無效腫瘤控制的功能失調狀態。找到一種方法使CAR改造的NK細胞更有效，同時又不影響其良好的安全性，這對於下一代細胞療法至關重要。當前的CAR-NK治療限制圍繞三個反覆出現的主題。首先，迄今為止，CAR-NK療法僅成功應用於非常狹窄的癌症特異性抗原庫。其次，有限的體內持久性和最終的免疫細胞衰竭對長期療效構成了重大障礙。最後，向腫瘤床的運輸受損和操縱敵對腫瘤微環境的脆弱性阻礙了 NK 細胞與其對手的有效相互作用，最終導致腫瘤免疫逃避。
我們主要討論一些最有趣的概念，CAR 進行基因重編程-NK 細胞克服了上述一些長期存在的障礙。
下一個前沿：多重基因編輯
合理的構造設計
除了將 CAR-NK 細胞重定向到不同的靶抗原外，最近的研究重點越來越多地轉向基於不同跨膜和細胞內共刺激結構域的模塊化組合的優化構建體設計，以增強 CAR-NK 效力。
藉助當今可用的通用基因工程能力，研究人員現在可以微調CAR 構建體系，以誘導更有效的抗腫瘤反應、增加抗原親和力或延長體內持久性。已經研究了多種共刺激元件產生更有效抗腫瘤反應的潛力，包括源自免疫球蛋白超家族（CD28、ICOS）、TNF 受體超家族（4-1BB、CD27、OX40 和 CD40）和其他包括CD40L和Toll樣受體 (TLR) 。與一些早期的CAR-NK構建體相比，這些構建體主要基於參與T細胞激活的共刺激域，越來越多的人對NK特異性信號轉接器的認識越來越多，其中DAP10、DAP12和2B4扮演著特別重要的角色。這些細胞內信號轉導接頭在與其各自的上游受體結合後介導 NK 細胞活化。在一項研究 CD19 導向的 CAR-NK 候選物的臨床前研究中，結合DAP10（NK 激活受體 NKG2D 的生理接頭）增強了單獨使用CD3ζ信號傳導的構建體的抗腫瘤效力。通過將DAP12包含在前列腺幹細胞抗原 (PSCA) 靶向CAR構建體中和另一組在間皮素靶向 iPSC 衍生的天然藥物中採用2B4增強信號策略，其他人也報導了類似的觀察結果。
武裝的CAR
前三代CAR對CAR結構設計的修改依賴於生理上發生的免疫細胞受體域。被稱為裝甲CAR的第四代構建體採用了截然不同的方法，通過結合分子有效載荷，從而賦予CAR修飾的免疫細胞具有在任何生理免疫細胞受體中都找不到的額外特徵和功能。這種方法使CAR構建體能夠被設計為解決細胞免疫療法的一些固有生物學局限性，從而將 CAR工程定位在合成生物學革命的中心（圖 1）。
圖 1 CAR結構設計的演變。
可以說，最緊迫的生物學約束是在缺乏外源性細胞因子支持的情況下限制了體內持久性。雖然細胞因子的臨床給藥是可行的，但它伴隨著相當大的安全問題，並且可能會無意中刺激免疫抑制性免疫細胞區室。為了克服這些障礙，我們的小組展示了組成型轉基因IL-15細胞因子支持如何在淋巴惡性腫瘤患者中實現CD19 靶向 CAR-NK 候選藥物的持續體內持久性和增強抗腫瘤功效。在現代雙順反子和多順反子載體平台的支持下，第四代載體可以包含不止一個理想的基因修飾，這種工程方法被稱為多重基因工程。在我們小組的 CD19 重定向 CAR-NK 產品的情況下，我們還包括一個使用誘導型 Caspase9 (iCasp9) 的分子安全開關，可以通過施用小分子二聚化藥物來激活該開關，以消除所有循環過激 NK 細胞，存在不良毒性事件。
CAR-NK免疫檢查點的基因破壞
儘管基於過繼 NK 細胞的治療取得了顯著的成功，但免疫細胞衰竭仍然是一個治療障礙，克服這一障礙的策略有必要提高長期體內抗腫瘤功效。為了構建下一代 CAR-NK 療法，基礎 NK 細胞生物學的基礎研究再次轉移到關注的中心，並且正在努力確定 NK 細胞免疫功能的負調節因子。在很大程度上受基於高通量單細胞研究的推動，對參與免疫細胞衰竭的轉錄網絡的理解的最新進展有助於建立功能失調的NK細胞的獨特特徵。已經提出了幾種不同的表型變化來描繪耗竭的NK細胞亞群，在這些標誌物中PD-1、LAG-3、TIM-3以及TIGIT和 KLRG1上調，這些標誌物賦予受損的細胞毒性潛力，因此體現靶向基因消融的假定候選者。
雖然高度可定製且功能強大的病毒載體平台的出現將CAR分子遞送到各種免疫細胞亞群中是過去十年細胞免疫療法取得非凡進步的先決條件，但越來越多地採用使用CRISPR/Cas9介導的靶向遺傳擾動基因編輯為調節潛在的免疫細胞生物學開闢了全新的途徑。多重基因工程策略尤其允許以定點方式進一步改進CAR修飾的免疫細胞，從而破壞對免疫細胞功能產生負面影響的分子途徑。包括我們在內的多個團隊已經開始了這一旅程，以設計具有增強效力、體內持久性和對功能衰竭機制的抵抗力的下一代CAR-NK免疫療法，最終目標是在我們的同時顛覆細胞療法領域今天就知道了（圖2）。
圖2 用於構建下一代CAR-NK免疫療法的多重工程策略。
抑制性免疫檢查點的基因靶向已經成為一個誘人的概念，它可以破壞CAR-NK功能的負調節因子，以增強抗腫瘤控制。雖然NK細胞激活狀態受到激活和抑制表面受體的複雜相互作用的複雜控制，但檢查點阻斷旨在使這種平衡偏向於增強的抗腫瘤免疫。NKG2A是最突出的種系編碼的抑制性 NK 細胞受體之一，其基因缺失先前與對表達其同源配體 HLA-E 腫瘤的細胞毒性潛力增加有關。阻斷TIGIT是維持平衡免疫反應必不可少的另一種抑制性檢查點，同樣已被證明可以防止 NK 細胞耗竭。我們的小組成功地靶向了細胞因子誘導的Src同源 2（CIS）蛋白，這是白細胞介素15信號上游的關鍵細胞因子檢查點，並在裝甲臍帶血衍生的CAR-NK細胞中實現了增強的代謝適應性和效應子功能。其他團體正在努力轉化 T 細胞免疫生物學背景下的經驗教訓，並正在研究PD-1/PD-L1和CTLA-4阻斷對 NK 細胞的影響。
抵禦免疫抑制性腫瘤微環境
除了NK內在免疫檢查點外，敵對的腫瘤微環境還產生了幾個外在因素，這些因素共同為浸潤免疫細胞創造了非常不利的環境。營養缺乏、酸度和缺氧的混合剝奪了浸潤效應細胞的抗腫瘤活性。
此外，腫瘤細胞已經進化出吸引調節性免疫細胞區室的機制，例如調節性 B 細胞和調節性 T 細胞以及髓源性抑制細胞 (MDSC)、腫瘤相關巨噬細胞 (TAM)、血小板、成纖維細胞和分泌免疫抑制細胞因子，包括轉化生長因子 β1 (TGFβ)、腺苷、吲哚胺 2,3-雙加氧酶 (IDO) 和前列腺素 E2 (PGE2)，進一步消除有效抗腫瘤反應的任何殘留物。通過阻斷 NK 細胞表面 A2A 腺苷受體 (A2AR) 的表達，這些細胞外免疫抑制代謝物之一腺苷已成功地變得無效。A2AR 缺陷的 NK 細胞在 BRAF 突變的黑色素瘤異種移植小鼠模型中表現出增強的腫瘤控制 [64, 65]。我們的團隊通過使用 CRISPR/Cas9 編輯對 TGFBR2 基因進行靶向擾動，成功地使原代人類 NK 細胞對免疫抑制性轉化生長因子 β1（TGFβ）具有抗性。基於這些觀察結果，我們還能夠證明，使用小分子抑制劑和基因消融對 TGFβ 受體信號傳導的破壞，在膠質母細胞瘤幹細胞 (GSC) 移植的小鼠模型中保留了 NK 細胞功能，並防止了 GSC-誘導 NK 細胞抑制表型。
設計用於臨床的安全 CAR-NK 產品
雖然這些新工具允許引入有意的基因干預，為擴大細胞免疫療法的範圍和效力開闢了機會，但它們構成了非特異性脫靶基因損傷導致意外不良結果的理論風險。因此，需要仔細考慮安全性，特別是在臨床中旨在管理 CRISPR/Cas9 基因編輯的細胞產品時。最近的創新，包括通過電穿孔瞬時傳遞高保真 Cas9 核糖核蛋白複合物，減輕了大部分不希望的基因組改變和強大的測序技術，這些技術足夠靈敏，甚至可以檢測到最罕見的異地病變用於臨床使用的基因工程淋巴細胞的額外安全範圍。
調節 CAR-NK 代謝
越來越多的工作已經確立了NK細胞有效啟動抗腫瘤反應所需的快速代謝重組的關鍵作用。因此，靶向免疫代謝途徑已成為一個有趣的概念，可以使NK細胞在代謝上更加穩健並保持其功能能力。在NK細胞中，IFNγ 的產生已被證明依賴於葡萄糖驅動的氧化磷酸化。一旦被激活，NK細胞就會發生顯著的代謝變化，從而增加糖酵解和氧化磷酸化 (OXPHOS) 的速率，以支持啟動有效免疫反應的能量需求 。NK 細胞代謝需求是高度特定於環境的；因此，需要精心策劃改變代謝機制和配置的調節途徑，以滿足動態能量和生物合成的需求。哺乳動物雷帕黴素複合物 1 (mTORC1) 靶點 (mTORC1) 在調節 NK 細胞代謝和促進早期 NK 細胞發育以及營養轉運蛋白和糖酵解酶的激活誘導表達中起關鍵作用，以支持成熟 NK 細胞的功能反應。事實上，我們的團隊和其他人已經證明，CISH信號傳導的中斷會代謝重編程CAR-NK細胞，以維持升高的mTORC1和MYC活性，促進體內持久性並增強抗腫瘤活性。
在轉錄水平上，甾醇調節元件結合蛋白 (SREBP) 和MYC已被確定為協調代謝適應的兩個中心調節元件，使活化的 NK 細胞能夠有效地發起免疫反應。MYC信號通過上調葡萄糖轉運蛋白和糖酵解酶的表達以及增加有絲分裂，使代謝機制適應NK細胞的特定要求。細胞內 MYC水平極短，並受MYC 蛋白生物合成和蛋白酶體降解的動態相互作用的嚴格調控。在 NK 細胞中維持細胞內MYC蛋白水平的一種機制是通過糖原合酶激酶 3 (GSK3) 介導的磷酸化以及隨後的泛素化和蛋白酶體降解。在AML患者中，GSK3表達已被證明被上調並與受損的NK細胞細胞毒性有關，這可以通過遺傳或藥理學GSK抑制來恢復。與這些觀察結果一致，已發現GSK3的藥理學抑制可穩定NK細胞中的MYC水平，從而增加其抗腫瘤效力。
維持 NK 細胞線粒體適合記憶形成
從支持免疫細胞分化和功能反應的代謝程序的動態相互作用中得出意義，已成為指導未來基因工程方法構建下一代CAR-NK免疫療法的當務之急。NK細胞歷來被認為是先天免疫系統。然而，由於細胞因子誘導的記憶樣表型的發現，最近的研究越來越多地挑戰這種範式 。Todd A. Fehninger 和他的團隊將這種方法應用於臨床，並證明用 IL-12、IL-15和IL-18對分離的 NK 細胞進行預激活可強烈誘導記憶樣 NK 細胞表型的形成，並具有增強的針對髓系的效應子功能白血病細胞 。基於他們的觀察，作者在一項評估白介素預激活 NK 細胞概念的 1 期臨床試驗 (NCT01898793) 中招募了AML患者，並觀察了九分之五 (56%) 可評估患者的臨床反應，包括四名完全緩解（44%）。將獲得的知識轉移到CAR工程化的NK細胞，該小組最近報導了CD19-CAR修飾的記憶樣NK細胞成功應用於異種移植淋巴瘤小鼠模型 。幾個小組現在正在研究和分析支持這種獨特的類似記憶的NK表型的免疫代謝特徵是的。隨著越來越多的證據表明線粒體功能障礙與NK細胞免疫反應受損有關，線粒體健康尤其成為關注的焦點，促進線粒體健康以改善 NK 細胞功能的策略已經在實施中。
結論
儘管最近取得了進展，但關於臨床給藥 CAR-NK 細胞免疫療法的基本問題仍然存在。其中包括最佳患者選擇，以及在其他既定治療方案（包括針對血液系統惡性腫瘤的自體和同種異體幹細胞移植）的背景下，CAR-NK 免疫療法的理想治療順序。未來的研究將需要解決如何通過識別預後生物標誌物和評估 CAR 重定向 NK 療法的最佳測序來最好地選擇 CAR-NK 免疫療法的高風險患者，以提供給已建立的治療算法。
展望未來，我們預計，在可預見的未來，自體和同種異體幹細胞移植形式的傳統非抗原特異性細胞療法將繼續在高危血液系統惡性腫瘤患者的管理中發揮重要作用，隨著時間的推移，基於抗原特異性 CAR 的療法很可能會升級到更早的療法。同種異體現成的基於 CAR-NK 細胞的療法尤其有望取代長期存在的治療範式，因為它們在同種異體環境中具有廣泛的適用性，並且與自體細胞產品相比具有巨大的成本效益。