肝細胞癌（HCC）是肝癌的主要組織學亞型，約占原發性肝癌的90%，通常由乙型/C型肝炎病毒引起，是全世界癌症相關死亡率的第三大常見原因。由於缺乏靈敏的診斷方法和生物標誌物，大多數HCC患者會在晚期被診斷出來，此時已無法進行有效的治療。因此，目前急需能夠在早期將HCC患者診斷出來的準確、有效的生物標誌物。
tsRNA是tRNA（轉運RNA）在核酸酶RNaseZ或Dicer作用下產生的、長度約18-40個核苷酸的非編碼小RNA。已有研究表明，tsRNAs對多種癌症的產生和發展起著至關重要的作用，例如，在B細胞慢性淋巴細胞白血病（CLL）中，ts-3676可能作為腫瘤抑制因子發揮作用。值得注意的是，tsRNA在血清中比較穩定，其可能是多種疾病（包括胰腺癌、乳腺癌和頭頸部鱗狀細胞癌）的生物標誌物。
近日，南京大學Yanbo Wang團隊、南京中醫藥大學Fangfang Jin團隊以及連雲港市第一人民醫院Liuqing Yang團隊合作在Frontiers of Medicine上發表題為「Serum mitochondrial tsRNA serves as a novel biomarker for hepatocarcinoma diagnosis」的文章。研究團隊通過RNA測序和定量逆轉錄PCR（ RT-qPCR ）在肝癌患者血清中鑑定出一種新的tsRNA——tRF-Gln-TTG-006，可作為有應用前景的血液生物標誌物，幫助醫生儘可能早地診斷出HCC患者。此外，研究團隊還發現tsRNA在HCC進展期間具有潛在的生物學功能。
文章發表在Frontiers of Medicine
為驗證血清中的tsRNA能否作為基於血液HCC檢測的生物標誌物，研究團隊使用包括tsRNA在內的高通量測序，對單個樣本進行了RT-qPCR 驗證（圖1）。在30名HCC患者與30名年齡和性別匹配的健康對照組的混合血清中提取總RNA進行測序，共篩選出233個tsRNA，其中有110個表現出失調（59個上調、51個下調）（圖2A和2B）。經分析發現，與健康對照組相比，HCC患者血清中有17種顯著差異表達的tsRNA。
圖1. 研究設計流程圖。來源：Frontiers of Medicine
接下來，研究團隊通過絕對定量分析了24名健康對照和24名HCC患者的血清樣本，並使用基於探針的RT-qPCR評估了樣本中表現出上調的前5個tsRNA 。分析顯示，與健康對照相比，HCC患者血清中的兩種tsRNA（tRF-Pro-AGG-005和tRF-Gln-TTG-006）顯著升高（圖2C-圖2G），表明tRF-Pro-AGG-005和tRF-Gln-TTG-006是最有希望區分HCC患者與健康個體的tsRNA。
圖2. 分析HCC中差異表達的血清tsRNA。來源：Frontiers of Medicine
為鑑定上述tsRNA是否具有診斷價值，研究團隊在兩個較大的獨立血清樣本隊列（來自連雲港第一人民醫院的80名HCC患者與79名健康對照；來自南京大學醫學院附屬鼓樓醫院的73名HCC患者和76名健康對照）中進一步分析了tRF-Pro-AGG-005和tRF-Gln-TTG-006的表達圖譜（圖3A和3B）。結果顯示，與對照組相比，HCC患者血清中tRF-Gln-TTG-006的濃度顯著升高（P<0.0001)；tRF-Pro-AGG-005在兩組之間差異較小。
接下來，研究團隊採用ROC分析，評估了基於風險評分的預測的敏感性和特異性，進一步確認了tRF-Gln-TTG-006的診斷價值。結果顯示，tRF-Gln-TTG-006顯示出較高的診斷用途，AUC為0.875，敏感性為80.4%，特異性為79.4%。此外，研究團隊還比較了tRF-Gln-TTG-006與臨床HCC生物標誌物甲胎蛋白（AFP）的診斷效果。ROC分析表明，tRF-Gln-TTG-006的診斷效果優於AFP，特別是在對早期HCC（I期）患者的診斷中，tRF-Gln-TTG-006的準確率顯著較高。
圖3. 來自不同醫院的兩個隊列中tRF-Gln-TTG-006的診斷分析。來源：Frontiers of Medicine
研究團隊分析了11名HCC患者HCC組織和配對血清中tsRNA的表達水平，發現tRF-Gln-TTG-006表達水平在兩者之間呈正相關（圖4）。為進一步分析上調的tRF-Gln-TTG-006是否從HCC細胞中釋放，研究團隊培養了HepG2細胞（人類HCC細胞系），並在不同數量的細胞的培養液中檢測tsRNA的表達。結果顯示，tRF-Gln-TTG-006的表達量與細胞數量成正比，表明tRF-Gln-TTG-006來源於HCC細胞（圖4）。
MINTbase比對顯示，tRF-Gln-TTG-006與線粒體tRNA相匹配，且位於tRNA二級結構的1-22位。因此，研究團隊推測tRF-Gln-TTG-006可能具有與miRNA類似的功能。為探索tRF-Gln-TTG-006的潛在功能，研究團隊使用RNAhybrid預測了tRF-Gln-TTG-006的目標基因，共獲得143個潛在的靶基因。基因本體論（GO）富集分析表明，這些靶基因富集了與腫瘤進展中主要步驟相關的鈣粘蛋白和β-連環蛋白。
進一步，研究團隊將tRF-Gln-TTG-006模擬物轉入HepG2和HuH-7細胞中（圖4D-圖4F），發現tRF-Gln-TTG-006降低了兩種HCC細胞系的集落形成能力。細胞凋亡實驗則顯示，tRF-Gln-TTG-006在HuH-7細胞中誘導更高的細胞凋亡率（圖4G和4H）。上述結果表明，tRF-Gln-TTG-006 可能作為一種腫瘤抑制因子，由HCC細胞釋放。
圖4. tRF-Gln-TTG-006的生物學功能。來源：Frontiers of Medicine
該研究通過高通量RNA測序和多組單獨的qRT-PCR評估，在HCC患者中定義了獨特的血清tsRNA特徵。特別地，研究團隊在HCC患者中鑑定出一種新的血清tsRNA——tRF-Gln-TTG-006，該tsRNA具有出色的區分HCC患者與健康對照的能力，可作為HCC早期診斷中有價值的生物標誌物。
參考文獻：
Zhan, S., Yang, P., Zhou, S. et al. Serum mitochondrial tsRNA serves as a novel biomarker for hepatocarcinoma diagnosis. Frontiers of Medicine, 1-11 (2022). doi：10.1007/s11684-022-0920-7
來源：測序中國