幹細胞領域迎來重大突破。
近日,中國科學院和深圳華大生命科學研究院等機構的科學家們宣布尋找到了一種讓 「成年」 細胞逆向轉化為具有更多分化可能性 「嬰兒」 細胞的方法。這是一種非轉基因、快速且可控的 「雞尾酒」 細胞重編程方法,華大官方通稿中把這種重編程的方法比喻為 「魔法藥水」。
在研究中,研究人員通過 「魔法藥水」 將人多能幹細胞誘導成類似受精卵發育 3 天狀態的人類全能幹細胞,即 8 細胞期胚胎樣細胞(8 細胞樣細胞,8-cell embryo-like cell,8CLC)。並且進一步證明產生的8CLC全能性細胞具有在體外或體內以類囊胚和畸胎瘤等形式產生胚胎和胚外譜系的能力。
通稿指出,這是目前全球體外培養的 「最年輕」 的人類細胞,也是科學家首次真正意義上將人多能幹細胞 「轉化」 為全能性的胚胎細胞。
此前,諾貝爾生理學 / 醫學獎得主日本科學家山中伸彌 (Shinya Yamanaka) 誘導培養的多能幹細胞是類似於受精卵發育 5-6 天的狀態。
值得一提的是,目前 Nature 上線的文章為未修訂版本,這篇已經上線的論文還未最終出版。
「這些全能性的細胞重建了受精卵僅分裂 3 次後的胚胎狀態,與過去的多能幹細胞相比,這種細胞可以分化為胎盤組織,並可能發育成為更優質的各類身體組織,為全球數百萬需要進行器官移植的患者帶來新希望。」 該論文通訊作者,中國科學院 Miguel A. Esteban 教授、Md. Abdul Mazid 博士和李文娟博士說。
「這一突破也是再生醫學與單細胞測序技術相結合的一個完美典範,」 該論文的另一位通訊作者、深圳華大生命科學研究院劉龍奇博士指出,「通過大規模的單細胞多組學分析,基於幹細胞技術對體外或體內獲得的細胞或組織進行高效、精確的鑑定,能夠極大加速再生醫學的研究。」
據悉,在這項研究裡面,使用了華大智造自主研發的 DNBelab C 系列高通量單細胞 RNA 文庫製備試劑盒(DNBelab C4)和 DNBSEQ 測序平台。
雞尾酒重編程方法逆轉多能幹細胞重回 「嬰兒期」
從受精卵開始,胚胎發育會經歷 2 細胞、4 細胞、8 細胞、16 細胞等多個階段,其中在受精後第三天通常會分裂成 8 細胞。從受精卵到 8 細胞胚胎過程中的每個細胞都具有全能性,也就是說處於這種狀態下的任一細胞都具有發育成完整個體的可能性。
不過,人類受精卵形成之初,基因組最初會處於沉默狀態,當受精卵分裂到 8 細胞階段時,其合子基因組才會迅速激活。研究 8 細胞期調控機制對深入理解早期人類胚胎細胞發育意義重大。因此,如果要獲得全能幹細胞,通常就需要讓幹細胞重返這一狀態。
合子基因:
受精卵在胚胎發育過程中表達的基因,受母體基因產物而激活。合子基因的表達是胚胎模式形成的開端。
確定好思路後,研究團隊利用測序技術篩選了靶向原始人類胚胎幹細胞 (ESC) 信號通路和表觀遺傳學通路抑制劑等多種化合物,通過測試近 14 種化合物確定生產 8CLC 的培養基。在驗證了 14 種化合物的多種組合形式之後,團隊建立了一套化合物組合 e4CL 的培養基以及兩種誘導 8CLC 的方法:直接誘導法和階段誘導法。上文提到的 「雞尾酒」 重編程方法即化合物組合 e4CL,分別包括 DZNep (3-deazaneplanocin A)+TSA (trichostatin A) PD0325901+IWR-1+Y27632 和 LIF(Leukemia inhibitory factor,白血病抑制因子)。
然後,為了測試用培養基生成的 8CLC 與人 8 細胞期胚胎(8C-embryo cell)的相識度,他們將階段誘導法獲得的 8CLC 與體內胚胎數據進行了整合分析。在整個過程中,誘導細胞細胞從類似胚胎第 7 天狀態到了第 5 天狀態,最後回到了第 3 天的狀態,成功將 primed 狀態的人多能幹細胞逆轉為 naive 狀態的人全能幹細胞 ——8CLC(類似於人 8 細胞期胚胎),有點像讓 「成年」 多能幹細胞重回 「嬰兒」 全能幹細胞。
「這篇文章最核心的部分在於,研究人員用化合物組合,把人類 primed 狀態的細胞向發育的更早期階段推進了一步,從而獲得了更早期、更接近全能分化潛能的細胞類型。」 國內幹細胞療法新銳睿健醫藥創始人魏君博士說。
naive 和 primed 是發育生物學中很重要的概念。這兩個概念最早在小鼠胚胎及幹細胞研究中被提出來,代表科學家是英國的 Austin Smith,他是胚胎幹細胞生物學領域的代表性人物。通常,以小鼠胚胎幹細胞 (mESC) 為代表的細胞類型稱之為 naive 狀態,也就是通常意義上的全能性幹細胞;以小鼠外胚層幹細胞 (mEpiSC:epiblast stem cell) 為代表的細胞類型稱之為 primed 狀態,它們在發育時期上比小鼠胚胎幹細胞稍晚,處於分化為三胚層的臨界點上,分化潛能較小鼠胚胎幹細胞略差。
魏君還強調,從生物學角度來說,與小鼠胚胎幹細胞相比,人類胚胎幹細胞和誘導多能幹細胞其實更接近 primed 狀態,而非全能性狀態。
第二步,研究人員繪製 8CLC 的染色質圖譜,並通過高通量測序 (scATAC-seq) 對 primed 狀態的胚胎幹細胞 (ESC) 、經 4cl 處理 12 天的 naive 多能幹細胞和經 e4cl 階段處理 5 天的細胞進行了轉座酶染色質單細胞分析,評估利用 e4CL(加強型 4 種化學物質 + 白血病抑制因子)的 8CLC 是否具有人類 8 細胞胚胎的染色質特徵。研究表明,利用 e4CL 誘導生成的 8CLC 能夠模擬出了人類 8 細胞胚胎的染色質結構。
接下來,他們通過深入分析基於水滴的 scRNA-seq 數據集,研究了 primed 和 naive 多能幹細胞轉化 8CLC 過程中的基因調控網絡(GRN)。8CLC 基因調控網絡的核心參與者包括全能性基因 TPRX1、ZSCAN4 和 DUXA。同時還繪製了 8CLC 轉化的分子路線圖,剖析了其中的基因調控網絡,鑑定出 DPPA3 和 TPRX1 為誘導 8CLC 的兩個核心因子。
最後,研究團隊還全面評估了 8CLC 的分化潛力,通過在多種試劑的作用下,分別測試了 8CLC 分化成滋養層幹細胞、幹細胞亞譜系、人胚狀體(類囊胚)、種間嵌合體(interspecies chimeras)和畸胎瘤的潛能。結果顯示,8CLC 具有胚胎和胚胎外發育能力,這說明此類細胞或將成為研究早期人類胚胎發育的重要資源。
「理論上應用前景更廣」
這項研究稱得上是繼科學家成功誘導出人類多能幹細胞後,再生醫學領域又一顛覆性突破。
多能幹細胞 (Pluripotent Stem Cells) 是一類具有自我更新、自我複製能力的多潛能細胞。具有分化出多種細胞組織的潛能,不過失去了發育成完整個體的能力,發育潛能有一定限制。
2006 年,日本科學家山中伸彌通過轉入是個轉錄因子首次將體細胞分化為幹細胞,並將此類幹細胞稱之為誘導多能幹細胞(iPSC)。五年後,這項技術獲得了 2012 年的諾貝爾生理學醫學獎,在醫學領域掀起了一場革命,同時也對發育生物學發展產生了深遠的影響。
自 iPSC 問世以來,就掀起了一股幹細胞研究和產業化應用的熱潮。目前,iPSC 產業化應用的主要領域包括疾病建模、藥物開發和發現⼯具、個體化醫學、毒理學測試、細胞療法等。
與人類多能幹細胞相比,全能幹細胞具有無限分化潛能,能夠分化發育成各種組織器官。「理論上,這種全能幹細胞具有更廣泛的應用前景。」 魏君說。
她告訴生輝,其一,理論上全能幹細胞能夠分化成更全面的人體細胞譜系,沒有分化的偏向性,這是全能幹細胞與多能幹細胞相比的一個巨大優勢。這也說明在利用這兩種細胞進行細胞治療產品的工藝開發上,全能幹細胞可能面臨更少的技術挑戰。
也就是說,對於一些多能幹細胞分化受限或者無法分化出的細胞類型,研究人員開發的全能幹細胞似乎更有用武之地。比如說,人類全能幹細胞可以研究那些無法在動物中建模的疾病機制。
其二,還有研究表明,通過將 iPSC 轉換為接近「naive」狀態後,這些細胞具有更高的基因編輯效率。這一證據表明全能幹細胞可以作為更好的基因編輯起始材料應用於再生醫學領域。
其三,全能幹細胞比多能幹細胞具有更短的倍增時間,所以有研究者認為這也是全能幹細胞在未來應用上的一大優勢。不過,魏君也提醒道,無論是利用全能幹細胞的分化優勢還是增殖優勢,這些都還需要進行更大樣本的系統性分析。
其四,目前的研究還在進一步探索全能幹細胞應用的可能性。從當前的臨床前數據看,人源多能幹細胞(胚胎幹細胞及誘導多能幹細胞)已經可以實現對腫瘤,神經退行性型疾病等多種疾病的治療,在未來更廣闊的適應症選擇上,全能幹細胞或許可以提供更開闊的思路。
官方通稿指出,這項研究一定程度上擴大了對早期人類胚胎發育的理解,有望讓個體化器官再生成為現實。由於這次得到的全能細胞更接近受精卵的原始狀態,因此具有更高的全能性。若用於再生醫學,培養出來的器官會越接近真實器官的狀態,更有利於器官移植和替換。以中國為例,據統計,每年約有 30 萬人等待器官移植,然而僅有2萬餘人能夠完成移植,缺口還比較大。
無論是細胞治療還是器官移植,上文提到的全能幹細胞在未來的治療中是否也會面臨免疫排斥問題?「免疫原性產生的機理比較複雜,有內在因素(包括基因組本身),也包含後天因素。在自然發育過程中免疫獲得這一領域,現在沒有看到全能幹細胞和多能幹細胞的大樣本深入研究,尚無法對兩者在免疫原性差異這一問題上做出定論。」魏君告訴生輝。
規模化生產同樣也是全能幹細胞未來實現轉化應用必須直面的問題。魏君指出,在這方面,全能幹細胞和多能幹細胞都需要面對同樣的挑戰,也就是如何在工業量級實現細胞的同步轉化,並且沒有全/多能幹細胞的殘留,這是這一領域工業應用中面臨的共性問題;此外,利用 iPSC 來實現 naive 狀態全能幹細胞的轉化是一個非常好的思路,但證明這種轉化方式的在體內的長期安全性,這也是產業化需要考慮的因素。