光緒帝在因為「百日維新」被慈禧囚禁了起來後，正當盛年時便突然死去，並且與慈禧的死只隔了一天，正因為光緒和慈禧的死亡時間如此接近，所以光緒帝的死因一直蒙上著種種迷霧。
第一種說法是光緒帝乃生病而崩，戊戌變法後，光緒帝失去了實權，徒留一個皇帝的稱號，這些打擊極大影響了光緒帝的身體健康，另外光緒自幼身體就不好，脾胃素來虛弱。光緒雖貴為天子九五之尊，但是周圍的人因宮中規矩限制，與他接近的人少之又少，只有慈禧可以親近光緒，當時的慈禧又驕奢淫逸，壓根不管光緒的生活起居。光緒的每餐雖有數十種菜餚，卻因自己胃虛弱都不能吃，光緒如果想加菜，需先通報慈禧，慈禧這時便會責備光緒鋪張浪費，在這種情況之下，光緒很容易得上重病，《清史稿》等官方記載中都說光緒久病體虛，持續帶光緒三十四年病入膏肓龍御歸天。但這些都是清朝朝廷記錄的，可信度並不算高。
第二種說法是慈禧密謀殺害了光緒。持這種觀點的人認為光緒雖然長期被囚禁，保皇黨卻極其地依靠他，因此慈禧一直折磨光緒，到了慈禧晚年，她自知時日無多，就想殺害光緒防止他重掌皇權。當時擔任起居住官並且能夠接近光緒的惲毓鼎，寫了一部《光緒外傳》，其中記錄了光緒臨死前的狀況，光緒三十四年秋忽然傳出了重病的消息，下詔京外名醫入宮診治，診治的時候，光緒靜靜的把雙手放置案上，寫出了自己的病情，診治的大夫都說光緒身體無恙。十月初十慈禧壽誕，光緒出瀛台替太后祝壽，有人看見他為了跪拜活動筋骨。十九日宮廷大亂，增加了守衛嚴查出入，有人傳言光緒帝駕崩。次日宮中恢復了平靜，午後傳出載灃監國、溥儀入宮教養之命。二十一日皇后入瀛台探視，光緒早已氣絕身亡。慈禧得知消息僅僅嘆息了幾聲。
有人根據這一則記錄暗示實際是慈禧害死了光緒，在清宮中擔任過女官的德齡女士，則是明確地指出是李蓮英下毒害死了光緒。
以上的兩種說法都言之鑿鑿且理由充分，但是清宮太監回憶錄《清宮瑣談》的說法是光緒死於飢餓。根據記載，光緒本來沒病，太醫開的也都只是去火保肝一類的藥物，可太監們在光緒死前就得到了光緒駕崩的消息。當時伺候光緒的人一共有六名，其中二人是餓死的，剩下的幾人也都飢餓難耐，「因餓失血者又凡三人」。光緒死前在床上召喚周太醫，這時光緒兩眼大瞪，四次用手指口，周太醫知道光緒餓急了，但實在是沒有吃的，就連他本人也三天沒吃東西了，後來光緒便慢慢沒有動靜了。不就醇親王見架，周太醫匯報皇上已經殯天，醇親王用鏡子試探光緒鼻息，確認光緒已死就匆匆而去了，不一會兒皇后趕來探視，隨後便把皇上駕崩的消息昭告天下了。
為了找到光緒的死因，我國學者對光緒的屍骨進行了全面的檢測。2008年10月2日這天，國家清史工程編纂委員會在北京舉行了「清光緒皇帝死因報告會」，報告會上稱光緒帝真正的死因是砒霜中毒，但究竟是誰膽敢對皇上下毒還沒有定論，此前說是慈禧下毒殺害光緒的證據似乎變的十分充分，但也有人認為是袁世凱投毒，因袁世凱告密戊戌變法失敗，光緒被囚禁十年之久。慈禧死後光緒一定又會君臨天下，袁世凱的性命鐵定不保，因此袁世凱下毒的可能性很大，此外袁世凱當時主領北洋軍隊，也有這個條件毒殺光緒帝。