撰文 | 言笑
HIV給人類健康造成了巨大威脅，據統計目前全球有近3800萬愛滋病患者。雖然口服抗逆轉錄病毒藥物在控制愛滋病毒水平方面非常有效，但這些藥物需要持續服用，並且很多具有較大的副作用，因此，徹底治癒的療法才是終結HIV的關鍵。隨著研究的深入，越來越多的長效抗病毒藥物已被批准，如2021年1月FDA批准的Cabenuva（卡博特韋/利匹韋林），該藥僅需一個月注射一次。除了抗病毒藥物，廣譜中和抗體（Broadly neutralizing antibodies, bNAbs）也受到人們的廣泛關注。這些抗體靶向HIV表面的膜蛋白ENV，可以有效的阻礙病毒對宿主細胞的感染。但是因為HIV病毒的高變異性，在臨床中僅使用一種bNAb可能導致病毒的耐藥性，因此目前很多研究者開始研究利用單抗聯合或者雙特異抗體對HIV進行治療。
有研究表明，在感染的早期階段開始接受抗逆轉錄病毒治療（Anti-Retroviral Therapy, ART）的HIV感染者，在接受兩種HIV bNAbs（3BNC117和10-1074）後，在沒有ART的情況下獲得了長時間的HIV抑制【1】。這兩種bNAbs的平均半衰期分別為16天和23天，病毒會在一定時間內反彈【2】。bNAb的持久性可以通過病毒載體轉導後肌肉的組成性表達來維持，但可能會由於糖基化不當而產生抗藥物抗體【3-5】。此外，從肌肉表達的抗體不會經歷類轉換重組（class switch recombination, CSR）或親和力成熟（affinity maturation）。針對這些問題，研究者開發了用於抗體表達的工程B細胞【6-10】。將Toll樣受體（Toll-like receptor, TLR）介導的B細胞離體活化與體內初免-加強（prime-boost）免疫結合起來，工程化B細胞允許免疫記憶、CSR、體細胞超突變（somatic hypermutation, SHM）和克隆選擇。通過工程離體移植以分泌bNAbs的B細胞在疾病模型中顯示出療效。然而，這種方法的臨床轉化需要專門的醫療中心、技術要求苛刻的方案以及供體細胞和受體的主要組織相容性複合體兼容性，因此，嚴重阻礙了該方法的擴大和應用。
2022年6月9日，來自以色列特拉維夫大學的Adi Barzel團隊在Nature Biotechnology雜誌上在線發表了題為In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice的文章。研究人員通過使用兩種腺相關病毒載體（一種編碼金黃色葡萄球菌Cas9，另一種編碼抗HIV bNAb 3BNC117）成功地實現了體內B細胞工程。將載體靜脈注射到小鼠體內後，B細胞被成功編輯並導致記憶保留和bNAb分泌，中和滴度高達6.8 µg ml-1。研究人員證實，用於表達治療性抗體的體內B細胞工程是一種安全、有效和可擴展的方法，它不僅適用於傳染病，還適用於非傳染性疾病（例如癌症和自身免疫性疾病）的治療。
為了在體內實現B細胞編輯，作者採用了一對AAV-DJ載體（圖1）。第一個載體中，金黃色葡萄球菌Cas9（Staphylococcus aureus Cas9, saCas9）由CMV啟動子表達，sgRNA（靶向IgH基因座）由U6啟動子表達，二者編碼在相同的AAV上；第二個載體編碼3BNC117 bNAb cassette，兩側有同源臂，用於整合到IgH基因座J-C內含子的CRISPR Cas9剪切位點。bNAb cassette在增強子依賴性啟動子（enhancer-dependent, ED）的控制下在整合時表達，其包括完整的輕鏈和重鏈的可變區（VL和VH），被編碼Furin切割位點和2A肽的序列分隔。可變重鏈之後是剪接供體序列，以允許與內源性常數外顯子在整合、轉錄和剪接時融合。上游多聚腺苷酸化位點用於終止整合時內源性可變重鏈的轉錄。該設計有助於破壞內源性IgH基因座和初始bNAb表達，允許隨後在抗原結合上激活工程化 B 細胞，從而導致分化為記憶細胞和漿細胞。
圖1. 將抗體靶向B細胞IgH位點，以促進抗原誘導的活化、SHM、CSR和親和力成熟。
對小鼠注射AAV之前先進行預免疫，模擬預先存在的感染。用gp120 HIV抗原（3BNC117的靶標）免疫C57BL/6小鼠。在免疫後第6天，注射bNAb、saCas9載體或兩者同時注射。這些小鼠在第8、23、68、98和128天接受額外的免疫接種。在加強方案之後，接受供體載體和saCas9載體的小鼠血液中含有高達5 µg ml-1的3BNC117 bNAb。從治療小鼠中純化的IgG可以中和自體YU2.DG和異源tier-2 JRFL HIV假病毒。同時注射bNAb和saCas9載體的小鼠比僅接受bNAb的小鼠具有高得多的3BNC117滴度。進一步，通過在骨髓上使用酶聯免疫吸附點（enzyme-linked immunosorbent spot, ELISPOT），證實了3BNC117分泌細胞的存在。這些數據表明，體內B細胞工程可實現抗HIV bNAb的高滴度。
在注射了bNAb和saCas9載體的所有小鼠中，表達3BNC117的細胞達到了總血B細胞的0.5%，在對照小鼠中則沒有。第136天對小鼠實施安樂死，脾臟中表達3BNC117的漿母細胞占23%、生發中心淋巴細胞占5%。作者在第136天接受治療的小鼠的肝臟和脾臟中提取了DNA，並對擴增的3BNC117 VH片段進行了Illumina測序。大部分突變庫在肝臟和脾臟之間共享，反映了AAV產生的異質性。作者發現，體內編輯和免疫計劃導致了變異的克隆擴展，這些變異源於AAV生產的異質性或體內SHM的異質性。克隆擴展的跨度有限，但幅度顯著。這些數據表明，體內工程化B細胞在生發中心經歷克隆擴張。
接下來，作者評估了體內工程方法的脫靶效應。對各組織中bNAb cassette的拷貝數進行量化，第37天的肝臟中的拷貝數最高，並在第136天僅降低了十倍，反映了肝臟中AAV episomes的高保留率。在第37天的血液中也發現了高拷貝數，但到第136天，水平急劇下降。從第37天到第136天，骨髓和淋巴結中的AAV拷貝數逐漸增加，表明這些組織中可能積累了表達3BNC117的細胞。作者還評估saCas9的全基因組脫靶活性。對小鼠基因組DNA進行CHANGE-seq，95%對應於on-target site。然後，對四個潛在的off-target位點以及on-target位點進行靶向測序。結果表明CRISPR-Cas9誘導的雙鏈DNA斷裂的易出錯修復在肝臟中更明顯，並且僅在IgH on-target位點。進一步，作者證實在CRISPR-Cas9介導的靶向整合之前，B細胞和非B細胞都可以在膜上表達抗體，但只有B細胞在抗原參與後增殖。
上述結果表明，CRISPR-Cas9切割具有高度的序列特異性，但也發生在不需要的組織中。為了進一步提高該方法的安全性，作者在CD19（B細胞特異性啟動子）的控制下對saCas9進行了編碼。C57BL6小鼠免疫20 ug HIV gp120，6天後，每隻小鼠共注射一個由CD19啟動子調控的saCas9載體，以及一個同時編碼bNAb和sgRNA的載體（圖2）。然後小鼠接受了六次額外免疫接種。在四次免疫接種後，接受治療的小鼠血液中已經含有高達 2 μg ml-1 的3BNC117 bNAb。無論是否進行了額外免疫接種，3BNC117 血液滴度在 30 天后保持不變。不管免疫方案如何，使用混雜或 B 細胞特異性調節saCas9表達獲得了相似的滴度。因此，通過B細胞特異性啟動子驅動 Cas9 表達可防止在不需要的組織中進行切割。
圖2. AAV載體設計及實驗方案
總的來說，該研究證明了B細胞可以在體內安全可靠地進行工程設計。單次全身劑量的雙AAV-DJ編碼小鼠CRISPR-Cas9和供體cassette允許位點特異性整合。在免疫接種時，工程化B細胞經歷了抗原誘導的激活，導致記憶保留、克隆選擇和分化為分泌bNAb 的漿細胞。與體外工程相比，體內B細胞工程簡單、快速且具有成本效益。它可以在護理點提供，不需要專門的設施。但該方法目前也沒有十分完善，作者認為可以從以下幾方面進行優化：（1）將bNAb編碼為單鏈以減少bNAb 重鏈與內源性輕鏈的錯配，從而提高安全性和有效性；（2）使用更特異性的核酸酶和使bNAb基因之前有剪接受體而不是啟動子，可以進一步提高安全性，以減少脫靶整合的表達；（3）在感染HIV樣感染的非人類靈長類動物中對該方法進行評估；（4）將該方法應用在其他持續性感染以及自身免疫性疾病、遺傳性疾病和癌症中。
原文連結:
https://doi.org/10.1038/s41587-022-01328-9
製版人：十一
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