前言
自2017年帕博利珠單抗被美國食品藥品監督管理局（FDA）批准用於治療錯配修復缺陷/高度微衛星不穩定（dMMR/MSI-H）型不可切除或轉移性經治的實體瘤患者，微衛星不穩定（MSI）成為全球首個指導腫瘤免疫治療的泛癌種分子標誌物，對腫瘤的診斷和治療有深遠的臨床價值。據報導，人類基因組中有1900萬個微衛星位點，而錯配修復系統缺陷並不會導致所有的微衛星位點不穩定，所以在MSI檢測時選擇高靈敏性和高特異性的微衛星位點尤為重要。
1 MSI檢測位點由雙核苷酸位點向單核苷酸位點進化
1997年，美國國家癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）提出了包括2個單核苷酸位點和3個雙核苷酸位點的5位點評價系統（BAT-26、BAT-25、D5S346、D2S123、D17S250）[1]。此次位點建議為開放性建議，會議同時提出了其他位點作為備選。傳統的NCI panel雖然一直被沿用，但其中雙核苷酸位點敏感性與特異性低，對MSI-H的檢出率只有60%～80%；同時對於MSH6突變引起的MSI檢出率低；並且雙核苷酸位點本身更趨於不穩定，對結果判讀難度增大，容易得到錯誤分類結果等方面的爭議一直存在。
2002年，Suraweera等提出pentaplex panel，該panel中的5個單核苷酸位點（BAT-26、BAT-25、NR-21、NR-22、NR-24）在結直腸癌中檢測靈敏度均在95%以上[2]。2004年，pentaplex panel升級為BAT-26、BAT-25、NR-21、NR-24、NR-27，多重體系可以更好地區分每個位點[3]，同時對於MSH6缺陷的結直腸癌有更高的靈敏度。同年，該panel被修訂版Bethesda指南推薦，同時指南指出對於傳統NCI panel，如果只有雙核苷酸位點發生突變，需要增加單核苷酸位點的數量，來排除MSI-L[4]，並指出單核苷酸位點的靈敏度優於雙核苷酸位點（見下圖重點標註部分）。
2004年修訂版Bethesda指南 J Natl Cancer Inst.
2004年，Bacher等人在266個位點中篩選了敏感性和特異性最高的5個單核苷酸panel（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、MONO-27）[5]。
至此基於PCR法的單核苷酸標誌位點BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、MONO-27等被認為具有較高靈敏度和特異性，在臨床廣泛使用。據美國病理學會（CAP）室間質評數據顯示，2012年單核苷酸位點panel的使用率超七成[6]。
2 單核苷酸panel與免疫治療
K藥獲批
從2015年新英格蘭雜誌首次報導MSI與免疫治療療效相關，到2017年5月FDA批准帕博利珠單抗（K藥）用於後線治療MSI-H泛實體腫瘤，再到2020年6月FDA批准K藥單藥用於不可切除或轉移性MSI-H/dMMR結直腸癌患者一線治療，相關臨床研究均使用了單核苷酸panel。
回顧幾個關鍵臨床研究：Keynote 016/164/012/028/158/177，其中MSI檢測均採用單核苷酸panel（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、MONO-27）[7,8]。
Keynote 158臨床研究文章
O藥/Y藥獲批
基於CheckMate142研究，FDA分別批准納武利尤單抗（O藥）單藥及聯合低劑量CTLA-4抑制劑伊匹木單抗（Y藥）用於MSI-H/dMMR 結腸直腸癌患者的治療。在O藥獲批的關鍵臨床研究CheckMate142中，中心實驗室均採用螢光PCR-毛細管電泳法進行MSI驗證，位點採用改良版的Bethesda panel（NCI Panel+ TGFβR2突變）進行檢測[9,10]。
從這些臨床研究中我們發現K藥臨床試驗中MSI檢測均採用全單核苷酸panel，而O藥臨床試驗中由於單獨使用NCI panel無法滿足MSI檢測準確性的要求，所以額外添加了TGFβR2突變檢測進行MSI的確認。
3 國內外指南及共識逐漸推薦單核苷酸panel
單核苷酸位點由於其更高靈敏度和特異性，已被修訂版Bethesda指南、NCCN、ESMO和國內專家共識聯合推薦。
早在2004年修訂版Bethesda指南指出單核苷酸panel——Pentaplex penal（BAT-26、 BAT-25、NR-21、NR-27 、NR-24）對MSI-H腫瘤的敏感性可能高於其他微衛星標記，推薦用於林奇綜合徵篩查[4]。
隨著免疫治療的發展，2019年8月ESMO發布癌症免疫治療專家共識，指出單核苷酸panel——pentaplex penal（BAT-26、BAT-25、NR-21、NR-27、NR-24）具有更高的靈敏度和特異性，推薦進行MSI檢測以指導免疫治療[11]。
《結直腸癌及其他相關實體瘤微衛星不穩定性檢測中國專家共識》（2019）指出，基於PCR法中的pentaplex panel的5～7個標誌位點組合BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27、MONO-27和NR-22被認定為PCR-MSI檢測的金標準，值得指出的是這些位點均為單核苷酸位點[12]。
《結直腸癌及其他相關實體瘤微衛星不穩定性檢測中國專家共識》（2019）
2021年NCCN胃癌指南中MSI檢測除了推薦NCI panel外，還推薦了單核苷酸位點panel[13]。
NCCN指南中明確指出，林奇綜合徵在MSI檢測位點選擇方面雙核苷酸位點的特異性不如單核苷酸位點[14]。
4 國內首款單核苷酸MSI panel試劑盒獲批上市
閱微基因的MSI檢測試劑盒於2021年11月正式獲批國家藥品監督管理局第三類醫療器械註冊證（國械注准20213400936），是國內首款基於全單核苷酸位點（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27、MONO-27）的MSI檢測試劑盒。自2012年獲得國內首個MSI檢測發明專利（專利號：ZL 2011 1 0152226. X）以來，閱微基因微衛星不穩定基因檢測試劑盒經過數萬例臨床樣本驗證及嚴謹的註冊臨床試驗，本產品的註冊臨床試驗由中國醫學科學院腫瘤醫院牽頭，復旦大學附屬腫瘤醫院和四川大學華西醫院三家頂尖腫瘤醫院共同參與，累計完成1000多例的臨床樣本驗證。本次臨床試驗選用的參比試劑是已獲得FDA批准用於PD-1伴隨診斷的羅氏 Ventana MMR RxDx Panel試劑，與MMR蛋白免疫組化對比陽性符合率94.79%，陰性符合率98.89%，總符合率97.25%，完全符合國家藥監局最新的MSI審查指導原則。針對MMR胚系突變檢測陽性樣本，本產品檢出率為100%[15]。
總結
從MSI位點靈敏度特異度研究，到免疫治療臨床研究，再到指南發展更替，可以看出單核苷酸panel由於優秀的靈敏度和特異度而在林奇綜合徵篩查、免疫用藥指導方面越來越受到臨床認可，在MSI臨床應用檢測時一定要選擇經過臨床驗證的位點，從而保證檢測結果的準確。
參考文獻：（向上滑動閱覽）
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[2] Suraweera N,et al. Evaluation of tumor microsatellite instability using five quasimonomorphic mononucleotide repeats and pentaplex PCR. Gastroenterology. 2002 Dec;123(6):1804-11.
[3] Buhard O, et al. Quasimonomorphic mononucleotide repeats for high-level microsatellite instability analysis. Dis Markers. 2004;20(4-5):251-7.
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[10] Overman MJ,et al. Durable Clinical Benefit With Nivolumab Plus Ipilimumab in DNA Mismatch Repair-Deficient/Microsatellite Instability-High Metastatic Colorectal Cancer. J Clin Oncol. 2018 Mar 10;36(8):773-779.
[11] Luchini Cet al. ESMO recommendations on microsatellite instability testing for immunotherapy in cancer, and its relationship with PD-1/PD-L1 expression and tumour mutational burden: a systematic review-based approach. Ann Oncol. 2019 Aug 1;30(8):1232-1243.
[12] 結直腸癌及其他相關實體瘤微衛星不穩定性檢測中國專家共識.實用腫瘤雜誌 2019第34卷 第5期
[13] NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: Gastric Cancer (Version 3.2021)
[14] NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: Genetic/Familial High-Risk Assessment: Colorectal (Version2.2022)
[15] https://www.nmpa.gov.cn/datasearch/search-result.html
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