一作解讀 | Cell 西北農林科技大學植物免疫團隊在小麥感條銹病機製取得重大突破

小麥研究者 發佈 2022-07-16T00:32:14.653296+00:00

由條形柄鏽菌小麥專化型(Puccinia striiformisf. sp. tritici,Pst)引起的小麥條銹病嚴重危害著全球小麥的生產安全。種植抗病品種是防控病害最為有效的措施。

由條形柄鏽菌小麥專化型(Puccinia striiformisf. sp. tritici,Pst)引起的小麥條銹病嚴重危害著全球小麥的生產安全。種植抗病品種是防控病害最為有效的措施。以往傳統的抗病育種方式主要通過利用抗病基因(Resistance gene, R),但這種抗性極易被病菌克服,一般情況下,小麥品種在生產上使用3~5年便「喪失」其抗鏽性。而感病基因(Susceptibility gene, S)是病原菌成功侵染、定殖和繁殖所必需的,由S基因突變所介導的抗性常具持久與廣譜特性,因此修飾編輯S基因是作物抗性改良的重要新途徑。

近日,西北農林科技大學植物免疫團隊潛心研究,在Cell雜誌在線發表了題為Inactivation of a Wheat Protein Kinase Gene Confers Broad-Spectrum Resistance to Rust Fungi的研究論文。該研究首次鑑定到了小麥中被病原菌效應子靶標劫持的感病基因TaPsIPK1(Puccinia striiformis-Induced Protein Kinase 1),闡明了TaPsIPK1作為小麥基礎免疫負調控因子,被條鏽菌效應子利用並放大負調控作用打破小麥的抗病反應,從而導致感病的分子機理;另外,TaPsIPK1編輯品系在田間試驗中表現出高抗條銹病且不影響小麥的主要農藝性狀,是一個可用於小麥抗病改良的感病基因,打破了小麥抗病育種中主要利用抗病基因的傳統思路,開闢了現代生物育種新途徑。

本研究工作中,作者主要有以下發現:

1. 小麥TaPsIPK1是一個被條鏽菌效應子PsSpg1劫持的感病基因

由於小麥條鏽菌不能人工培養,無法進行遺傳轉化,該團隊從小麥與條鏽菌互作入手,利用BSMV-VIGS技術體系,對小麥與條鏽菌互作中的差異表達激酶基因進行抗鏽性分析,鑑定到編碼胞質類受體激酶基因TaPsIPK1負調控小麥抗病性。為進一步明確其功能,作者創製了TaPsIPK1RNAi及過表達轉基因小麥材料,發現RNAi穩定沉默降低小麥感病性,過表達則增強小麥對條鏽菌的感病性;同時,利用基因組編輯技術在六倍體小麥中同時敲除了A、B、D基因組的TaPsIPK1基因,發現TaPsIPK1突變體對中國主要條鏽菌流行小種CYR32、CYR33和CYR34表現出廣譜抗性。

圖1. TaPsIPK1負調控小麥對條鏽菌的抗性

為明確TaPsIPK1敲除突變體的抗性機理,作者研究發現敲除TaPsIPK1可提前激活PTI相關防禦基因表達與MAPK磷酸化,更快速啟動ETI相關過敏性壞死反應,但並不組成型的激發明顯的免疫反應。這一現象引發作者思考,這種宿主免疫調節因子是否被病原菌效應子積極地瞄準,從而促進條鏽菌寄生?因此,作者利用酵母雙雜交技術在小麥與條鏽菌互作cDNA文庫篩選其互作蛋白,發現了條鏽菌毒性分泌蛋白PsSpg1與TaPsIPK1互作,依賴TaPsIPK1促進條鏽菌致病性;有趣的是,作者發現在小麥葉鏽菌以及稈鏽菌也存在PsSpg1的同源蛋白,但相比於條鏽菌PsSpg1,PgSpg1以及PtSpg1存在一個N端可變區,TaPsIPK1與PsSpg1、PtSpg1互作,而與PgSpg1不互作,且TaPsIPK1突變體對條鏽菌與葉鏽菌感病性降低,但對稈鏽菌感病性沒有明顯變化。由此,作者認為小麥TaPsIPK1是一個被條鏽菌效應子PsSpg1劫持的感病基因,TaPsIPK1與Spg1的特異互作介導小麥感銹病。

圖2. 條鏽菌效應子PsSpg1依賴TaPsIPK1介導小麥感病性

2. 效應子PsSpg1通過增強TaPsIPK1的激酶活性,促進TaPsIPK1入核介導條鏽菌致病性

為明確PsSpg1是如何操縱TaPsIPK1介導感病性的,作者由TaPsIPK1激酶活性出發,體外磷酸化實驗發現TaPsIPK1具有自我磷酸化的激酶活性,且PsSpg1能夠增強TaPsIPK1的自我磷酸化。進一步作者藉助菸草異源表達發現,TaPsIPK1自身表達定位於細胞質膜,PsSpg1存在時質膜定位的TaPsIPK1減少,更多TaPsIPK1進入細胞核,這一現象在寄主小麥中也得到了證實。由此,作者認為PsSpg1促使TaPsIPK1從質膜釋放進入細胞核。那這一現象是否與感病性有關呢?作者通過在TaPsIPK1突變體中分別表達帶有核定位信號(NLS)的TaPsIPK1與核輸出信號(NES)的TaPsIPK1,接種條鏽菌毒性小種發現,過表達帶有NLS的TaPsIPK1增強了小麥對條鏽菌的感病性,而過表達含有NES的TaPsIPK1則不能。因此,作者提出TaPsIPK1的核定位是其介導小麥感病性的關鍵。

圖3. PsSpg1增強TaPsIPK1的磷酸化,促進TaPsIPK1入核,觸發小麥的感病性

3. 在細胞核,TaPsIPK1磷酸化轉錄因子TaCBF1d改變其轉錄調控活性

鑑於TaPsIPK1核定位對其介導感病性的重要性,在酵母雙雜交篩選獲得的候選靶標中,作者重點關注了含有NLS的小麥蛋白,通過互作驗證發現轉錄因子TaCBF1d與TaPsIPK1互作。為明確TaCBF1d在小麥與條鏽菌互作中的功能,作者創製了TaCBF1RNAi及過表達小麥,發現RNAi植株對條鏽菌抗性降低,過表達植株對不同條鏽菌生理小種表現廣譜抗性,為小麥抗銹病正調控因子。鑑於PsSpg1RNAi、TaPsIPK1KO和TaCBF1dOE均對條銹病表現抗性,作者對三者抗銹病的生物學相關性進行了比較,通過RNA-seq測序發現這三個小麥材料中含有628個表達模式相似的共同差異表達基因(DEGs),Gene Ontology(GO)分析顯示鞘脂代謝過程涉及的基因被富集。鞘脂類在調控植物細胞程序性死亡中具有重要的作用,由此作者推測這些基因表達的改變可能與寄主受到毒性條鏽菌侵染時抗性反應的提高有關。

圖4. TaPsIPK1與小麥對條鏽菌正調控因子TaCBF1d相互作用

體外激酶活性實驗證明了TaPsIPK1可磷酸化TaCBF1,而PsSpg1能夠增強TaPsIPK1對TaCBF1的磷酸化。那麼TaCBF1磷酸化水平對其轉錄調控功能有什麼影響?作者通過ChIP-seq鑑定到TaCBF1調控的下游基因,比較分析磷酸化失活與激活的TaCBF1對下游基因的轉錄調控,發現TaCBF1磷酸化抑制其對抗病相關基因的轉錄,反饋增強了對TaPsIPK1的轉錄,放大了TaPsIPK1效應,促進小麥感病。至此,作者系統揭示了PsSpg1-TaPsIPK1-TaCBF1磷酸化-轉錄調控級聯反應介導的小麥感條銹病機制。

圖5. PsSpg1增強TaPsIPK1對TaCBF1d的磷酸化,而TaCBF1d磷酸化水平影響其轉錄調控功能

4. CRISPR-Cas9編輯TaPsIPK1創製了具有持久廣譜抗鏽性的小麥材料

在該研究中,作者利用 CRISPR-Cas9 技術編輯小麥 TaPsIPK1基因獲得了TaPsIPK1敲除突變體,編輯植株對條鏽菌和葉鏽菌均表現出廣譜抗性,且並不影響小麥的株高、分櫱、穗長、千粒重等主要農藝性狀。在2020年與2021年陝西省條銹病大流行年份,田間試驗結果均表明,TaPsIPK1編輯小麥表現出高抗條銹病,且維持了野生型的主要農藝性狀,在生產上展示了良好的應用潛力。該研究創製出的廣譜抗病材料為小麥抗銹病育種提供了寶貴的初始材料。

圖6. 田間種植的TaPsIPK1KO小麥高抗條銹病且保留了關鍵農藝性狀

該研究鑑定到小麥中第一個被鏽菌效應子操縱的感病基因,對條鏽菌和葉鏽菌表現廣譜持久抗性的感病基因編輯植株為小麥育種提供了極有價值的種質資源,具有重要的理論與應用價值,為利用感病基因改良作物抗病性提供了更堅實的理論與技術支撐,為作物抗病育種提供了新思路。

西北農林科技大學博士後王寧、副研究員湯春蕾和博士生樊昕為該論文的共同第一作者,王曉傑教授和康振生院士為通訊作者,中國科學院遺傳與發育生物學研究所周儉民研究員參與了該項研究工作。該研究獲得了國家重點研發計劃項目、國家自然科學基金、創新國家小麥產業技術體系、陝西省科技創新團隊和高等學校學科創新引智計劃等項目的支持。

原文連結:

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(22)00779-6

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