2022年8月2日，The Plant Journal雜誌在線發表了德國亞琛大學和馬普所Acevedo-Garcia等人題為「Barley Ror1encodes a class XI myosin required formlo-based broad-spectrum resistance to the fungal powdery mildew pathogen」的研究論文。作者們克隆了大麥白粉病廣譜抗性基因Mlo介導抗病反應所必需的Ror1，並對其蛋白結構進行了分析。該基因編碼XI類肌球蛋白，部分與過氧化物酶體共定位，可能驅動細胞內抗菌或細胞壁組分等的轉運過程，進而促進細胞外免疫。
一、研究背景
Mlo（Mildew locus o）基因功能缺失（mlo）可介導大麥對白粉病的廣譜和持久抗性，同時該基因在多種單子葉和雙子葉植物中功能保守，其突變型也具有白粉病等病菌抗性。Mlo基因編碼具有7個跨膜螺旋結構的膜蛋白，C-端和N-端分別位於細胞內外，其中C-端尾部含有鈣調蛋白結合域，與鈣調蛋白結合介導致病菌侵染。過去的研究通過EMS誘變Ingrid背景下的高抗性mlo-5，在M2代發現了部分感病材料，進一步利用這些材料鑑定到兩個不同的位點Ror1和Ror2（required for mlo resistance），Ror1和Ror2是mlo介導抗病反應所必需的。其中Ror2基因被成功克隆，該基因編碼SNARE（solubleN-ethylmaleimide-sensitive factor attached protein receptor）蛋白，定位於質膜上，通過與SNAP34和VAMP721蛋白形成三元複合物進而參與抗病反應。Ror1基因被定位於大麥1H染色體長臂著絲粒周圍，重組率低且該區段與水稻共線性差，因此未能成功克隆。
肌球蛋白（myosin）是真核細胞內的一類ATP依賴型分子馬達，對細胞的運動與細胞內物質傳輸起著重要的作用。在植物中，肌球蛋白可以結合不同類型的物質，促進細胞內的轉運過程。植物中的肌球蛋白只有兩類，即VIII類和XI類，它們在結構域、分子量和動力學特性等方面有所不同。目前，VIII類蛋白的功能尚不明確，XI類蛋白被報導參與細胞器沿肌動蛋白微絲的運動過程。
二、研究結果
2.1 Ror1基因的定位與克隆
大麥Ror1基因最早由Collins等（2001）定位在1H染色體0.2-0.5 cM的遺傳區間內，後來Acevedo-Garcia等（2013）進一步篩選大麥YAC文庫，利用染色體步移的方法，將Ror1定位到大麥1H染色體長臂近著絲粒0.18 cM遺傳區間，側翼標記為AK375542（Pol）和AK355699（Con）。在當時，基因組組裝主要利用細菌人工染色體（BAC）簇，BAC簇的排序方式有多種。與遺傳作圖相比，利用Hi-C可對著絲粒附近區域的BAC簇進行排序，Hi-C圖譜將按連續順序（bin）將每個BAC簇分配到染色體上。
在本研究中，作者利用BLAST確定前期定位的Ror1側翼基因在基於Hi-C組裝的大麥基因組上的位置，大多數基因位於bins 205–211之間，相當於約12 Mb的區間內。通過觀察這些基因的順序，發現與水稻相比，在Ror1基因側翼的一組共分離標記在大麥中發生了倒位，導致離Ror1基因最近的側翼標記由AK375542（Pol）變成AK250464（圖1），該基因定位在AK250464（HORVU.MOREX.r3.1HG0046150）和AK371545（HORVU.MOREX.r3.1HG0046850, Con）之間，相當於Hi-C bins 208和209，作者們推斷Ror1基因位於這兩個簇上或它們之間。這兩個相鄰的BAC庫之間的距離小於180 kb，HORVU.MOREX.r3.1HG0046150與HORVU.MOREX.r3.1HG0046850之間共有50個注釋基因，包括26個高置信度基因。
圖1 Ror1側翼基因在大麥中的倒位
接下來，作者通過對6個化學誘變的mlo-5ror1雙突變體與親本BC Ingridmlo-5（mloRor基因型）進行RNA-Seq比較分析來確定Ror1。將獲得的所有基因型的RNA-Seq讀長與目標區間內的BAC進行比對，發現多個mlo-5 ror1雙突變體的MLOC_19838和MLOC_52235基因發生突變，兩個基因注釋都為肌球蛋白XI類基因。對序列進行進一步分析發現它們屬於同一個肌球蛋白XI類基因。作者將完整的候選基因進行組裝，結合RNA-Seq讀長，發現該複雜的基因由39個外顯子組成（圖2A），編碼1,509個胺基酸，在最新的Morex基因組上注釋為HORVU.MOREX.r3.1HG0046420，Ingrid品種的該基因與Morex的編碼序列一致，mlo-5 ror1-1和mlo-5 ror1-2突變體的基因編碼區發生胺基酸的替換，mlo-5 ror1-3、mlo-5 ror1-5、mlo-5 ror1-6和mlo-5 ror1-7的基因發生錯義剪切，導致該基因提前終止。為了明確在目標區間內是否存在其他基因的變異，作者通過將RNA-Seq讀長與最新的Morex V3基因組比對，只發現mlo-5 ror1-2突變體在HORVU.MOREX.r3.1HG0046420的誘導突變，沒有發現其它的突變基因，說明HORVU.MOREX.r3.1HG0046420是Ror1候選基因。
2.2 Ror1蛋白結構和進化樹分析
與其它的XI類肌球蛋白相似，Ror1的結構如圖2B所示。利用大麥、水稻和擬南芥中的肌球蛋白進行進化樹分析，表明Ror1與擬南芥AtMyo11A1和AtMyo11A2，水稻Os02g0545000直系同源（圖2C）。蛋白印跡分析表明，7個突變體中僅有一個突變體ror1-1的Ror1蛋白積累量與野生型相似（圖3），其突變位點造成錯義突變（G715E）。參考雞的肌球蛋白Myo5A三維結構，該突變位點位於肌球蛋白關鍵結構relay和converter的中間（圖4），relay是肌球蛋白產生動力的元件，與核酸結合域和converter結構域相連。relay和converter中間區域可以影響肌球蛋白動力特性，包括ATP結合和水解，因此G715E可能對Ror1產生嚴重影響。此外，ror1-2也發生了錯義突變（G156E）。
圖2 Ror1結構和進化樹分析
圖3 Ror1蛋白免疫印跡分析
圖4 蛋白三維結構分析
2.3 Ror1蛋白水平和亞細胞定位分析
在白粉菌侵染24-72 h後，Ror1條帶最明顯，之後變弱，其~110 kDa的剪切產物也具有相同的規律（圖5）。之後，作者們通過施用可以阻礙ATP結合的肌球蛋白抑制劑NEM（N-ethylmaleimide），發現ror1-4中白粉菌侵染性沒有顯著提高（圖6），推測Ror1可能是大麥中介導mlo抗病性的唯一肌球蛋白。亞細胞定位表明，大麥葉表皮細胞中YFP標記的Ror1分布於細胞核和細胞質（圖7），部分與可移動的亞細胞區室共定位，如過氧化物酶體。因此，Ror1可能驅動細胞內物質和細胞器的轉運過程，進而介導細胞外的免疫。
圖5 白粉菌侵染後Ror1蛋白水平分析
圖6 藥理學分析
圖7 Ror1亞細胞定位
2.4 過表達Ror1的C-端造成顯性抑制效應
過去的研究表明肌球蛋白C-末端的過表達會抑制肌球蛋白的功能。作者們通過瞬時過表達Ror1的C-末端蛋白（879-1509），發現產生了與ror1突變體相似的表型，表明Ror1也具有顯性抑制效應（圖8）。
圖8 過表達Ror1的C-末端蛋白分析
三、研究結論
本研究成功克隆了Ror1基因，該基因編碼XI類肌球蛋白，位於relay和converter界面的單個胺基酸突變可造成Ror1功能缺失。接種白粉菌之後Ror1蛋白水平顯著提高；Ror1部分與過氧化物酶體共定位，過表達C-末端蛋白造成顯性抑制效應。Ror1可能驅動細胞內物質和細胞器的轉運過程，進而介導細胞外免疫。
原文連結
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.15930
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