一文了解伴隨診斷主要基因檢測方法

小桔燈網 發佈 2022-08-18T07:52:46.204770+00:00

鑑於第一代 PCR 採用的核酸燃料對實驗人員及環境造成較大傷害,PCR 完成之後開蓋檢測易污染造成假陽性結果,檢測耗時長且操作麻煩易出錯及只能做定性檢測,二代 PCR 得以發展 並成為目前國內 PCR 技術主流。

來源:醫世象


伴隨診斷需要通過對樣本進行基因測序等分析手段進行藥物受體作用位點的確定,目前常用樣本類型為組織以及體液。


對組織進行分子分析的技術稱為組織活檢,具體是指應診斷、治療的需要,從患者體內切取、鉗取或穿刺取出病變組織,對其進行分子分析。


對腫瘤伴隨診斷來說,腫瘤組織活檢是獲取腫瘤 DNA 的金標準。對液體進行分析的技術稱為液體活檢,具體是指通過對患者的體液中的分析物(CTC、cfDNA、ctDNA 等)進行分子分析,以指導患者的個性化治療及預後。


組織活檢與液體活檢技術優缺點對比



從臨床應用上看,組織活檢與液體活檢各有優劣。雖然目前基於液體活檢的腫瘤伴隨診斷近年來處於蓬勃發展之中,但並非意味著其已經能取代組織活檢技術,兩者合作互補或許能大大提高診斷效率,減少過度治療。隨著液體活檢技術不斷發展,未來基於液體活檢的腫瘤伴隨診斷或將進一步替代組織活檢技術,成為伴隨診斷檢測的主力軍。


伴隨診斷主要基因檢測方法


伴隨診斷是通過基檢測等手段進行藥物受體作用位點的確定,隨著靶向藥的應用推廣,伴隨診斷逐步確立起指導治療的重要地位。在伴隨診斷所用檢測技術中,PCR、NGS、FISH 是目前市場上應用最廣泛的技術,其各有優劣,在各大伴隨診斷企業中均有分布。


(一)PCR


PCR(聚合酶鏈式反應)是一種用於放大擴增特定 DNA 片段的分子生物學技術,可以看作是生物體外的特殊 DNA 複製,其最大特點是能將微量的 DNA 大幅增加。在存在 DNA模板、引物、dNTPs、適當緩衝液 (Mg2+) 的反應混合物中,在熱穩定 DNA 聚合酶的催化下,對一對寡核苷酸引物所界定的核酸片段進行擴增,這種擴增是以模板 DNA與引物之間的變性、退火、延伸三步反應為一個周期,循環進行,使目標 DNA 片段得以擴增。


普通 PCR 原理圖



最初的普通 PCR 技術只能通過對靶基因進行擴增,然後採用瓊脂糖凝膠電泳對產物進行分析,實現簡單的定性分析,這是第一代 PCR。鑑於(1)第一代 PCR 採用的核酸燃料對實驗人員及環境造成較大傷害,(2)PCR 完成之後開蓋檢測易污染造成假陽性結果,(3)檢測耗時長且操作麻煩易出錯及(4)只能做定性檢測,二代 PCR 得以發展 並成為目前國內 PCR 技術主流。第二代 PCR 就是螢光定量 PCR 技術(Real-Time PCR),也叫做 qPCR, 是指通過應用螢光染料或螢光標記的特異性探針(如 Taqman Probe),在 PCR 反應體系中加入螢光基團對聚合酶鏈反應產物進行標記跟蹤,實時監控反應過程,結合軟體對螢光信號 進行分析,實現基因檢測的定性和定量分析。qPCR 常用於傳染病病原體檢測,疾病耐藥基因研究,藥物療效考核,遺傳疾病診斷。隨著反應循環次數的增加,被擴增目的基因片段呈指數增長,通過實時檢測對應的隨擴增而變化螢光信號強度,求得 Ct 值,利用已知模板濃度的標準品作對照,即可得出待測標本目的基因數。由於 rPCR 定量過程通過 Ct 值間接反映,因此稱為第二代 PCR。


實時螢光定量 PCR 原理圖



應用螢光染料:SYBR green:在 PCR 反應體系中,加入過量 SYBR 螢光染料, SYBR 螢光染料特異性地摻入 DNA 雙鏈後,發射螢光信號,而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發射任何螢光信號,從而保證螢光信號的增加與 PCR 產物的增加完全同步。


應用特異標記探針:Taqman Probe:PCR 擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的螢光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告螢光基團和一個淬滅 螢光基團。探針完整時,報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收;PCR 擴增時,Taq 酶的 5』-3』外切酶活性將探針酶切降解,使報告螢光基團和淬滅螢光基團分離,從而螢光監測系統可接收到螢光信號,即每擴增一條 DNA 鏈,就有一個螢光分子形成,實現了螢光信號的累積與 PCR 產物形成完全同步。


螢光染料 VS 螢光探針



隨著 PCR 系統的進一步發展已經對檢測,一種具備較高靈敏度和特異性的數字PCR 技術開始被廣泛應用於腫瘤臨床檢測和科學研究中。數字PCR(Digitai PCR, dPCR)是一種新興的核酸檢測技術,通過將每個核酸分子分配到一個獨立的空間內,避免選擇性擴增對擴增結果的干擾,可實現核酸模板絕對定量、稀有突變檢測、拷貝數變異、DNA 甲基化、基因重排等檢測功能。由於數字 PCR 可以實現直接定量分析,被稱為第三代 PCR。


數字 PCR 原理圖



通過稀釋樣品 DNA 到對應的檢測孔中,經過 PCR 擴增之後,向每個孔里加入特異性螢光探針與產物雜交,然後直接計數樣本中突變型和野生型等位子的數量。dPCR 常用於大量正常細胞群中檢測少數含突變的細胞,主要應用於突變分析、等位基因缺失、 混雜 DNA 的癌症檢測等等。


三代 PCR 的技術優劣



(二)NGS


NGS(高通量測序技術)是指通過模板 DNA 分子的化學修飾,將其錨定在納米孔或微載體晶片,利用鹼基互補配對原理,在 DNA 聚合酶鏈反應或 DNA 連接酶反應過程 中,通過採集螢光標記信號或化學反應信號,實現鹼基序列的解讀,一次性可完成幾十 萬至上百萬序列的測定。


NGS 是基於 PCR 和基因晶片發展而來的 DNA 測序技術。一代測序為合成終止測 序,而二代測序開創性的引入了可逆終止末端,從而實現邊合成邊測序。二代測序在 DNA 複製過程中通過捕捉新添加的鹼基所攜帶的特殊標記(一般為螢光分子標記)來確定 DNA 的序列。


目前高通量測序的主要平台代表有羅氏公司(Roche)的 454 測序儀(Roch GS FLX sequencer),Illumina 公司的 Solexa 基因組分析儀(Illumina Genome Analyzer)和 ABI 的 SOLiD 測序儀(ABI SOLiD sequencer)。


主流 NGS 測序平台技術原理、特點及適用範圍



由於在二代測序中,單個 DNA 分子必須擴增成由相同 DNA 組成的基因簇,然後進行同步複製,來增強螢光信號強度從而讀出 DNA 序列;而隨著讀長增長,基因簇複製的協同性降低,導致鹼基測序質量下降,目前二代最長的讀長是 Miseq 的 600bp。二代 測序適合擴增子測序(例如 16S、18S、ITS 的可變區),而基因組、宏基因組 DNA 則需要使用鳥槍法打斷成小片段,測序完畢後再使用生物信息學方法進行拼接。


NGS 原理圖



(三)FISH


FISH(螢光原位雜交)是一種廣泛被臨床認可的檢測基因拷貝數變化的方法,如果被檢測的染色體或 DNA 纖維切片上的靶 DNA 與所用的核酸探針是同源互補的,二者經變性-退火-復性,即可形成靶 DNA 與核酸探針的雜交體,將核酸探針的某一種核苷酸標 記上報告分子如生物素、地高辛,可利用該報告分子與螢光素標記的特異親和素之間的 免疫化學反應,通過螢光顯微鏡鏡檢,對待測 DNA 進行定性、定量或相對定位分析, FISH 技術可用來檢測基因擴增、缺失及重排,如用於已知基因或序列的染色體定位、未 克隆基因或遺傳標記及染色體畸變的研究。


FISH 原理圖



FISH 技術優勢有:

①螢光試劑和探針經濟、安全;

②探針穩定,一次標記後可在兩 年內使用;

③實驗周期短、能迅速得到結果、特異性好、定位準確;

④FISH 可定位長度 在 1kb 的 DNA 序列,其靈敏度與放射性探針相當;

⑤多色 FISH 通過在同一個核中顯示 不同的顏色可同時檢測多種序列;

⑥既可以在玻片上顯示中期染色體數量或結構的變化, 也可以在懸液中顯示間期染色體 DNA 的結構。


但 FISH 不能達到 100%雜交,特別是在應用較短的 cDNA 探針時效率明顯下降。


雖然 NGS 作為新興測序技術近些年來發展勢頭迅猛,但目前市場上的伴隨診斷測序服務和產品仍以 PCR 技術為主,且與 PCR 和 NGS 相比,FISH 技術總體來說應用較少。


PCR、NGS、FISH 技術優缺點對比



各類型癌症相關的生物標誌物及對應靶向/免疫療法


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