文章信息
題目：Pyruvate, phosphate dikinase regulatory protein impacts light response of C4 photosynthesis in Setaria viridis
刊名：Plant Physiology
作者：Chris J Chastain，Kuenzang Om et al.
單位：Minnesota State University-Moorhead
日期：25 July 2022
01
摘要
在C4植物中，丙酮酸（Pyr）磷酸二激酶調節蛋白（PDRP）以光/暗依賴的方式調節C4途徑酶Pyr磷酸二激酶（PPDK）的活性。這種調節作用對C4途徑功能和整體C4光合作用的重要性尚不清楚。為了解決這個問題，我們評估了C4植物狗尾草（Setaria viridis）的CRISPR–Cas9 PDRP敲除（KO）突變體體內PPDK磷酸調節和全葉光生理學。PDRP KO系葉片提取物中未檢測到PDRP酶活性。同樣，在PDRP調節Thr殘基磷酸化的PPDK在葉提取物中免疫檢測不到。快速葉提取物中的PPDK酶活性在PDRP KO系中組成性高，無論葉的光照或黑暗預處理如何。淨CO2同化的氣體交換分析表明，當葉片從暗到高光或從低光到高光轉變時，PDRP KO葉片具有明顯較慢的光誘導動力學。在最初的光誘導階段的30 min，KO葉片與野生型（WT）相比，淨CO2同化率降低15%。儘管誘導動力學較慢，但我們發現當在正常空氣中和標準生長室條件下生長時，KO系的生長和活力與WT難以區分。然而，在波動光照條件下生長的PDRP KO植物表現出Fv/Fm的連續多日逐漸下降，這表明由於缺乏PDRP，光系統II發生了漸進性損傷。總之，我們的結果表明，PDRP在C4光合作用中的作用之一是在入射光的動態變化期間確保最佳的光合誘導動力學。
Fig. 1
02
技術路線
WT S. viridis (accession ME034v) was used for all experiments
CRISPR/Cas9 gene-editing, transgenic plant regeneration, and genotype analysis
In vitro PDRP protein kinase assays
Immunoblot detection of PPDK and phospho-PPDK in leaf extracts
PPDK enzyme assays
Gas exchange measurements
Leaf pyruvate content
Fluctuating light experiments
03
主要結果
3.1 PDRP敲除系在體外和體內缺乏PDRP活性
基於Cermák等人的植物基因組工程（2017）的CRISPR-Cas9系統基因編輯體系被用於敲除S.viridis基因組的單個PDRP基因（Sevir.2G348700）。使用該方案，通過潮黴素選擇回收六株T0植物，每株代表一個獨立的轉化事件。PCR擴增的PDRP外顯子1基因組DNA區域的桑格測序顯示，每個T0系都是由CRISPR Cas 9引導RNA側翼的相同68 bp缺失的純合子（圖2A，B）。三個T0 KO系，命名為T27、T28、T29，進行自交以產生分離的T1代植株。
隨後，通過PCR篩查磷酸轉移酶轉基因（缺失）對這些基因進行基因分型，確認轉基因（Cas9和潮黴素可選標記）已分離出來。將篩選的純合T1 KO植物進行繁殖，最終產生T3代種子，用於產生本研究中使用的所有PDPR KO植物。
如圖2B所示，CRISPR-Cas 9介導的68bp缺失修飾了外顯子1的閱讀框，從而在第一外顯子的幀內終止密碼子到達下游之前編碼22個錯義胺基酸。未測試來自該修飾位點的截短多肽的表達。然而，所有三個PDPR敲除系均顯示缺乏PDRP酶活性（圖2C），表明如果任何截短的PDRP累積，則其是無功能的。這是通過使用高度靈敏的體外基於免疫的PDRP蛋白激酶（PPDK磷酸化）測定建立的，在該測定中，我們沒有檢測到PDRP KO系的脫鹽粗葉提取物中存在的任何殘餘PDRP活性（圖2C）。如圖所示，野生型葉提取物含有顯著的PDRP活性，PPDK的ADP依賴性磷酸化證明了這一點。WT對照減ADP反應中的微弱條帶（圖2C，上圖）表示少量內源性PPDK-ThrP通過體外反應中用作PDRP來源的10μL WT葉提取物引入測定。
Fig. 2
值得注意的是，PDRP敲除測定的負ADP控制通道中的這條微弱帶缺失，這表明PDRP KO葉提取物中缺乏內源性PPDK-ThrP（以及PDRP活性缺失）。這一觀察結果在用PPDK-ThrP抗體探測的從光照和暗適應的葉片中分離的葉片提取物的免疫印跡中更清晰地顯示（圖3）。
在本實驗中，WT的葉片和兩個PDRP敲除品系T27和T28首先暗適應4小時，然後在高輻照度下照射30分鐘。對於野生型植物，我們發現在黑暗4小時後，內源性PPDK已高度磷酸化（圖3 A和B上）。當WT葉片暴露於強光下30分鐘時，暗適應葉片中存在的幾乎所有PPDK-ThrP都被脫磷酸化為活性脫磷PPDK。相反，我們無法在來自兩個PDRP敲除品系的葉片提取物中檢測到任何PPDK-ThrP信號，無論對葉片進行暗處理還是光處理，再次證明PDRP敲除了植物中沒有PDRP活性。當抗磷酸化PPDK探測的印跡被剝離並用抗PPDK抗體重新處理（用於檢測總PPDK）時，PPDK帶強度在WT和KO葉片之間似乎相等（圖3A，B下），這表明PPDK水平不太可能受到PDRP損失的影響。
Fig. 3
最後，代表PDRP在敲除植物中缺失的第三條證據是葉片PPDK活性的體內光/暗調節的喪失（圖4）。使用保持原位PPDK激活狀態的快速提取和測定方法，我們表明暗適應PDRP敲除葉中的PPDK活性與光照葉中的基本相同。相反，暗適應WT葉片中的PPDK活性在很大程度上受到抑制。在暗適應WT葉片中剩餘的約8%的PPDK活性可能代表源自胞漿PPDK亞型的PPDK活性，由於PDRP是質體定位的，因此其不受光/暗調節。值得注意的是，PDRP敲除葉片中的PPDK比活性在光照和暗照下都與光照WT葉片記錄的高PPDK比活度相當。
Fig. 4
3.2 標準生長室條件下的生長表型
最初的PDRP敲除轉化體和隨後的T3代後代系被再生並保持在2%CO2中，以防止PDRP的丟失會損害生長和發育，從而危及PDRP敲脫植物的恢復。直到從高CO2生長的植物中收穫純合的T3種子，才評估正常空氣中的發芽和生長。有趣的是，當在標準生長室條件下（正常空氣條件，~700μmolm-2sec-1光照，16/8小時晝夜，31°C/22°C光周期）發芽和生長時，所有三個獨立的PDRP敲除系在生長和活力方面與野生型植物在視覺上無法區分（圖5）。
Fig. 5
3.3 輻照度水平對WT和PDRP敲除葉片PPDK激活狀態的影響
如上所述，光照C4葉片中可提取PPDK活性的水平隨著入射光強度的增加而成比例增加，達到約1/2陽光下的最大水平（約1000μmol m-2sec-1）。一般認為，PPDK活性的輻照度水平依賴性完全是由於PDRP的磷調節作用，而不是任何其他試劑。我們通過測量從低到高輻射下照射的T27和WT葉片中的可提取PPDK活性來檢驗這一假設（圖6）。
在這裡，PPDK活化狀態由暗適應的3cm中間葉切片製備的快速葉提取物確定。對於WT葉片，PPDK激活狀態（PPDK比活性）隨著入射輻照度的增加而增加，直到達到600μmol量子m-2sec-1附近的最大水平。相反，T27葉片在所有輻照度水平和黑暗條件下的PPDK活化狀態與WT葉片中PPDK的最高光激活狀態相當。
Fig. 6
3.4 PDRP損失對葉片光合CO2同化和氣體交換特性的影響
我們通過光照時間過程中葉片的氣體交換分析，研究了PDRP損失對S.viridis葉片淨CO2同化（Anet）的影響。具體來說，在記錄數據之前，將植物從生長室中移出，並在黑暗中適應30分鐘。在這個適應期之後，在120分鐘的時間過程中，每分鐘記錄一次高光和低光的變化間隔。具體而言，首先記錄Anet 30黑暗期，然後用強光（1500μmol量子m-2秒-1）照射30分鐘，然後轉變為弱光（100μmol量子m-1秒-1）30分鐘。在最初的約10分鐘光誘導階段後，我們觀察到T27葉片的Anet比率低於T27葉片。WT葉片（圖7A），在30分鐘高光照期結束時，Anet的比率比WT低約15%。然後，當葉片轉變為較低的輻照度（100μmol量子m-2sec-1）時，WT和T27的Anet比率迅速下降，但WT葉片中的Anet仍高於T27葉片（圖7B）。
Fig. 7
為了研究T27葉片的較低Anet持續時間是否超過30分鐘，我們通過將初始高輻照度照射期延長至90分鐘來重複該實驗。如圖8A所示，在進入照射期約30分鐘時，T27葉片表現出與圖7A相同的約15%的較低的Anet vs.WT。然而，隨著光照時間超過30分鐘，T27和WT的Anet在90分鐘光照結束時逐漸收斂，這表明T27葉片中PDRP的損失大大延長了光合誘導階段的持續時間（圖8A）。為了了解T27葉片中較低的Anet是否可歸因於氣孔CO2擴散的限制，我們對氣孔導度（gs）進行了相應的測量（圖8B）。有趣的是，在光照期的15分鐘左右，T27葉片中的gs較低，但在額外的20分鐘光照後增加到WT水平（圖8B）。在整個90分鐘的光照期間，發現內部葉片CO2濃度（Ci）的相應測量值與WT相當（圖8C）。因此，T27觀察到的短暫較低的氣孔導度（圖8B）不太可能影響我們觀察到的該基因型的Anet率（圖8A）。
Fig. 8
為了確定圖7A和8A所示T27葉片中PDRP的損失與Anet減少之間的任何聯繫，我們評估了類似高光照葉片（1300μmol量子m-2sec-1與1500μmol量子m-2sec-1，圖7A）葉片提取物中的PPDK激活狀態。這裡，PPDK活化狀態是從漂浮在dH2O上並從上方照射的3厘米中間葉切片製備的快速葉提取物中測定的。如圖7B所示，在光照開始時，WT PPDK活性在約6分鐘內從零快速增加到幾乎完全光激活水平。相反，T27 KO葉片中的PPDK酶活性從暗適應葉片中的高初始活性到30分鐘光照期結束保持不變（圖7B）。當WT葉片轉變到黑暗中時，PPDK的失活顯示出比PPDK光激活慢，需要約30分鐘的黑暗才能完全失活，這對於其他C4物種來說是典型的。當受照的T27葉片轉變回黑暗時，PPDK激活狀態（在進入黑暗期的10、20和30分鐘時從WT葉片中交替採樣）顯示為保持較高且不變（圖7B）。
3.5 全葉丙酮酸水平
由於發現PDRP KO葉片中的PPDK活性在黑暗中最高且恆定（圖7B），我們推測葉肉基質中PPDK介導的PEP合成在黑暗中也具有活性。因此，我們認為，一旦葉片適應黑暗，Pyr的葉肉基質庫可能會下降到異常低的水平，因為它會轉化為PEP。為了檢驗這種可能性，我們評估了2小時黑暗適應期結束時和光照開始後3分鐘的全葉Pyr水平。應該注意的是，雖然這些測量值代表了組合束鞘和葉肉綠質組織中的Pyr，但玉米的全葉測量值已顯示出定性地反映了分離葉肉細胞中Pyr的暗/光變化。對於暗適應葉片，我們發現T27葉片中的Pyr水平約為WT葉片的40%（圖9）。當這些暗適應的葉片暴露於強光下3分鐘時，T27葉片中的Pyr顯示出與暗水平相比保持相對不變，而在WT葉片中降低。
Fig. 9
3.6 恆定或波動光照條件下生長期間的全葉PS II效率
我們試圖評估PDRP的損失如何在快速變化的入射光條件下影響C4葉片的光生理學，這是田間生長植物的典型情況（例如，雲層或較低冠層葉片上的光斑對直接陽光的短暫干擾）。為此，我們通過脈衝幅度調製（PAM）葉綠素螢光（Fv/Fm）測量了在波動光照周期下生長的T27和WT植物與如前所述在穩定高光照或穩定低光照下生長的植物的PS II效率。
在本實驗中，波動光照條件包括在16小時的光周期內，在1200μmol量子m-2 s-1下重複1分鐘，在300μmol量子m-1下重複4分鐘。穩定的光處理植物在每16h光周期850μmol量子m-2 s-1或90μmol量子m-1的恆定光照下生長。實驗開始時，第0天的初始測量結果表明，WT和T27葉片中的Fv/Fm大致相同（約0.71，圖10）。在波動條件下7天後，T27葉片中的Fv/Fm顯著下降至第7天的0.37。對於WT波動光處理葉片，Fv/Fm在第3天下降至0.64，然後在第7天增加至0.68。在第7天結束於0.68的運行過程中，穩定強光處理的WT葉片的Fv/Fm基本上沒有變化。因此，波動光處理的T27葉片的Ff/Fm從0.70急劇下降至0.37直接歸因於PDRP的損失，因為沒有觀察到波動光處理WT葉片或穩定強光處理T27葉片中的類似下降。我們還在非常低的光照（90μmol量子m-2 s-1）下進行了額外的7天SL實驗。在低穩定光照條件下，從第0天（~0.70）到第7天（~0.73），T27和WT的Fv/Fm值保持相對恆定，在每天的每個時間點，基因型之間的Fv/Fm值幾乎相同（圖10）。
Fig. 10
04
結論
我們發現，在穩定的光照條件下，PDRP的損失對S.viridis KO植物的生長和活力沒有明顯影響，這反映了這項研究。然而，與PpcK敲除突變體不同，我們能夠證明C4葉片中PDRP的丟失如何轉化為KO葉片中顯著的生理變化（即，較慢的光誘導動力學、波動光中Fv/Fm的降低）和生化變化（即黑暗中較低的葉片Pyr水平）。因此，我們得出結論，PDRP比PpcK更嚴格地整合到C4途徑調節中，並在確保較高的晝夜和季節淨碳固定率方面具有潛在的更大的調節影響，表面上是針對受到動態光照的C4葉片。
05
獲取原文
原文連結：
https://academic.oup.com/plphys/article-abstract/190/2/1117/6649706?redirectedFrom=fulltext
PDF獲取：
https://www.scientsgene.com/h-nd-130.html#_np=107_423
文末附件。
END
06
廣告
賽思基因科技（青島）有限公司致力於開發轉基因和基因編輯中的「硬核科技」，突破遺傳轉化中的基因型限制，輔助基因編輯育種。目前公司擁有國內數量最多的穩定遺傳轉化體系，包括但不限於油茶、花生、藜麥、大白菜、小白菜、辣椒、菜心、油菜、紫菜薹、櫻桃蘿蔔、胡蘿蔔、甘藍、抱子甘藍、寶塔菜、紫/黃/綠花椰菜、青花菜、西瓜、南瓜、甜瓜、茄子、梨樹、棗樹、大豆、棉花等遺傳轉化體系。
公司可為廣大科研和育種工作者提供穩定的，非嵌合的，多品種的過表達、基因沉默株系和基因編輯突變體。期待與您的深入合作，共同推動中國種業的進步。