一個完整的PCR擴增體系主要由引物、酶、dNTP、模板和Mg2+等基本要素所組成。
引物設計的原則 引物不但決定了PCR擴增片段的長短，也是PCR擴增特異性的關鍵，要保證PCR擴增的特異性，引物一定要與模板DNA具有完全的互補性。
理論上，任何模板DNA，只要其核苷酸序列是已知的，就能按其序列設計合成一定長度的互補寡核苷酸鏈做引物，從而將特定長短的靶DNA在體外大量擴增。
一、引物設計的一般原則
引物長度以18~30bp為宜，以20bp左右最為常用。
引物過短，易導致非特異擴增。
較長的引物雖特異性好，但在引物內易形成二級結構，如髮夾環， 1. 引物擴增跨度(擴增片段長短): 擴增片段在普通PCR以200~500bp為宜 特定條件下可擴增長至10kb的片段 實時螢光PCR則為70~ 150bp
2.引物 G +C比例及鹼基:
G+C含量以140%~60%為官，G+C比例太低擴增效果不佳，G+C比例過高易出現非特異條帶。
此外，ATGC最好隨機分布.避免出現重複的基序。
重複的基序通常包括簡單重複如4個以上核苷酸的重複序列(--CCAGCT---CCAGCT--)、倒裝重複如4個或4個以上核苷酸自我互補序列基序(--TTACCG---CGGTAA--)和均一的多聚核苷酸的成串排列如4個或4個以上的相同的核苷酸---TTTTT---)。
3.引物的熔解溫度(Tm):
引物的Tm與其長度、序列組成(G+C比例)和濃度有關，通常理想引物的Tm應在55~60°℃引物的Tm對PCR擴增的特異性影響較大。 引物對之間的Tm的差異應不超過2~3℃，如差異過大，擴增效率將大大降低，甚至不出現擴增，因為如果引物Tm較高，當在低於理想的退火溫度時，將出現錯誤的擴增引導。
如果Tm較低，則引物只在於高於理想的退火溫度時以低濃度結合。引物的Tm可按下式計算：即Tm=2°C(A+T)+4°C(G+C),退火溫度的選擇通常是低於Tm約5℃。
好啦，今天先給大家介紹以上三點引物設計的一般原則，還有6大原則，關注我，下期告訴你~
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