4.1
知識分子
The Intellectual
圖源：National Library of Medicine
撰文|王家槐（哈佛醫學院退休教授）
不久前，我收到來自哈佛醫學院的一封電郵，通知我2023年六月將會有一個Harrison/Wiley實驗室的團聚。隨著團聚日子慢慢接近，已經不幸意外過世二十多年的Don Wiley的非凡成就和個人魅力又不時在我腦海里湧現。
他和英國病毒學家John Skehel在1981年合作發表在Nature上的流感病毒感染寄主細胞的關鍵分子，血凝素的結構研究奠定了學界對於這一類RNA病毒，包括愛滋病毒和最近流行的新冠病毒感染機理的理解。他和他的哈佛同事，免疫學家Jack Strominger合作在1987年發表在Nature上的組織相容抗原分子結構的研究深刻影響了細胞免疫學和醫學科學。
他的這兩項卓越成就註定會在科學史上留下印跡。和他相識二十年的點點滴滴也促使我落筆寫下此文以資紀念。
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年輕的現代生物學家們
James Watson 1956-1976期間在哈佛生物系當教授時，他大力主張把哈佛的經典生物學改造成為分子生物學，來迎接由DNA雙螺旋的發現所引起的生物學革命。他破格引進了相當一批年輕的、活躍在新興領域的、冒尖的生物學家。其中最早選拔的分子遺傳學家Mark Ptashne連跳兩級，1971年到了哈佛直接就成了正教授。那個時候，生物系的系名也更新為生物化學和分子生物學系。
幾乎在同一個時間，主要是在Watson的推動下，也是在1971年系裡前後在幾個月內從哈佛內部招了兩個結構生物學家，Steve Harrison 和Don Wiley。Steve是從Junior fellow（哈佛選拔最優秀的博士畢業生給予接近於教授待遇的三年的任職）選上的，而Don則是在哈佛化學系剛剛拿到博士學位後，不經過博士後直接當上教授的。從一開始，兩位年輕的結構生物學家就決定合作建立一個共享的結構生物學Harrison/Wiley實驗室。
有趣的是，他們兩位對於系裡其他同事所從事的當時最熱門的基因調控等分子生物學問題並不感興趣。Harrison的雄心是測定一個球狀病毒的結構。七十年代初，蛋白質結構研究才剛剛起步，全世界一共只有很少數幾個蛋白質的結構花了二三十年才被測定，遑論比一般蛋白質至少要大上百倍的最小的病毒？一位最權威的專家稱之為蛋白質結構研究難於攀登的珠穆朗瑪峰。Steve是世界上第一個成功測定病毒結構的科學家。Wiley的興奮點是從蛋白質結構研究中探討病毒如何能感染寄主細胞的。他是看到了英國科學家Skehel 最新的文章，報導了他們能夠從流感病毒表面酶解下來一個專門負責感染寄主的名為血凝素（hemagglutinin）的刺突蛋白（spike）。Don認為這是一個非常有意義而沒有被探索過的領域。
一個里程碑式的研究：
流感病毒何以如此兇險？
身為英國皇家協會會員的John Skehel畢生從事流感病毒研究，1975-1993曾經是世界衛生組織的流感國際合作中心的主任。Wiley很快和 Skehel聯繫上，並且還專門去Skehel實驗室作過學術休假好幾個月。一個流感病毒專家，一個結構生物學家，兩個人一拍即合，決定研究血凝素的晶體結構。血凝素位於病毒表面，它對感染寄主細胞有兩個關鍵功能：1）識別細胞受體，讓病毒附著其上；2）介導病毒外層脂膜和細胞膜融合，以便病毒的遺傳物質能進入細胞內繁衍。他們希望一個血凝素的三維結構能有助於理解其分子功能。那時候，還沒有任何人有培養過像血凝素那樣的很不容易拿到化學純的糖蛋白的晶體。他們開始的運氣很好，選中的病毒株血凝素正好是唯一能長出晶體的一種。在七十年代，測定一個分子量在七萬左右的蛋白質是一個很艱巨的任務。Wiley招到了從牛津大學畢業的博士後Ian Wilson, 兩個人一起努力。龐大的晶體衍射的數據收集要論年才能完成。尋找解結構必須的重原子衍生物是一個非常令人沮喪的過程。當時整個哈佛都沒有足夠大的計算機可供浩繁的計算，更談不上如今到處都有的計算機圖像顯示儀可用於分子模型的構建。Skehel頻繁地來訪鼓勵他們，帶來充足的晶體生長材料。前後至少六年的努力，他們終於「看到」了血凝素的真面目。
這是一個像Wiley本人一樣的有將近200Å的「高個子」分子：一個球狀的「頭部」和一個細長而結實的「腿部」，錨定在病毒的脂膜上。三個分子組成一個三聚體（見附圖紅，綠，藍三色），「聳立」在病毒表面。
它所顯示的生物學價值幾乎立刻讓他們激動不已。多年來讓病毒學家和免疫學家們困惑的流感病毒的抗原性很清楚地主要分布在頭部四個區域,很容易被人體免疫系統接近。這是第一次科學家們能夠從分子水平解釋一個病毒是如何慢慢變異而逃避人類免疫系統的攻擊的。而在大量可以不斷變異的區域中間，他們又發現了一個位於頂部，極其保守的「小坑「， 應該是受體結合的位點。後續研究證明，他們找到了受體結合位點。重要的是他們進一步發現感染人類的上呼吸道和感染禽類的消化道的受體分子有立體化學差別，解釋了禽流感毒株和人流感毒株的差別，以及禽流感病毒通過變異越過物種差別感染人類，引起類似於歷史上兇險的流感大流行的風險。這個結構立刻引起學界的轟動。
但是一個令人困惑的問題始終在Wiley腦子裡容繞，而且每次作報告時最後他都會給聽眾提出來，供大家思考。問題是：受體的位點的確是很正確地在分子的頂部，朝向寄主細胞。但是為啥血凝素分子那個負責細胞融合的部分會「藏在」分子中間，距離頂部100Å的地方呢？這是不合理的。已知病毒在進入寄主細胞後，在一個包含體內遇到酸性環境會發生劇烈變化，病毒的脂膜和寄主細胞膜才融合。為此，Skehel/Wiley團隊又經過十幾年的艱苦努力，解析了血凝素在酸性條件下的結構。同樣令人震驚的是分子結構的確發生了蛋白質結構領域裡從未見過的劇烈變化。 一段本來藏在三聚體內疏水的多肽段，現在摔出去100Å，的確指向寄主細胞方向，以便插入寄主細胞膜內。而本來連結病毒膜的部分發生180度彎折，也指向了寄主細胞。這清楚的指明，在這個酸性環境裡，血凝素可以把病毒的膜和細胞膜「拉」到一起。此時，結合受體的頭部卻讓開了。這樣，血凝素分子就變成了一個能介導病毒膜和細胞膜融合的結構。位於病毒表面的刺突分子真是以如此巧妙的方式，分步完成了感染寄主的功能。
Skehel/Wiley團隊對流感病毒血凝素的研究成為了同類RNA病毒里程碑式的典型。後來證明愛滋病毒和新冠病毒等的刺突蛋白都採用了非常相同的機理，去感染寄主細胞。Don Wiley 對血凝素結構的深入理解對於病毒作用原理及其醫學價值的貢獻是十分巨大的。
「一個結構改變一個領域」
還在全力以赴研究血凝素的時候，Don Wiley就聽說了奇妙的組織相容性抗原（MHC）。醫學界很早以前就知道，器官移植的排斥是由於不同個體之間有不同的組織相容性抗原所引起。
後來證明，器官移植的排斥實際上是一種細胞免疫反應。免疫的本質就是識別「非己「，爾後加以排斥和清除。1974年一位瑞士免疫學家Zinkernagel和一位澳大利亞免疫學家Doherty一起發現，淋巴細胞在殺死受病毒感染的細胞時，必須同時識別外源的病毒以及受感染細胞自身表達的MHC分子，即所謂雙重識別。這兩位科學家對細胞免疫系統的重大發現在兩年後得了諾貝爾獎。
後續研究表明，病毒感染寄主細胞後，MHC分子會把病毒在細胞內被降解的小片段（一般是8-10個胺基酸大小的肽段）遞呈到受感染細胞的表面，就好像是給「病態」細胞做了一個標記。當「巡邏」的淋巴細胞，T細胞遇到這個病態細胞時， T細胞表面的受體分子TCR將識別這個抗原片段和MHC分子的複合物，從而觸發免疫反應，清除病態細胞。因此，MHC是一個極端重要的免疫分子。每個個體都有自己遺傳來的獨特的MHC分子。所以它們以前被「誤認為」組織相容性抗原。但是MHC是如何發揮作用的呢？眾說紛紜。
Wiley在哈佛生化系的同事，免疫學家Jack Strominger就是研究MHC的。人類的MHC又叫人淋巴細胞抗原(HLA)。七十年代後期，Don敏銳地感到了測定MHC結構對免疫學的巨大意義，他開始和Jack商量合作研究HLA的結構。生化系每個新學年都會有一個在校外的聚會，由每個教授給新入學的研究生介紹他們的研究方向和最新成果，以利學生和教授雙向選擇研究生課題。1978年，一位女生叫Pamela Bjorkman（她現在是加州理工學院的教授）在會上聽到了Wiley講血凝素的進展，非常興奮，認為用X-射線晶體衍射研究蛋白質結構對解決生命奧秘太有吸引力了。Jack的一個研究生Jim Kaufman鼓動她參與最前沿的HLA結構研究。Pamela 就成了Don和Jack聯合培養的學生。那個時候雖然哈佛生化系在分子遺傳學領域世界領先，但是分子克隆技術還沒有成熟。Pamela只能培養巨大數量的細胞，然後用胃蛋白酶從那些細胞表面把HLA切下來。200升細胞才能提純出3-4毫克蛋白，只夠200次晶體生長實驗。1981年我在那個實驗室里，親眼目睹那可憐的晶體又薄又易碎，對年輕的Pamela是個巨大的挑戰。尋找重原子樣品，收集衍射數據，解析結構，又是一個非常令人沮喪的長過程。多年後Pamela回憶道，要不是Don的充滿熱情的鼓勵，她很可能會放棄了。Don一再以不可動搖的信心告訴她，結構一定能解出來，而且這個結構將會具有巨大的意義。Don 還安排有經驗的博士後多方面給予具體的幫助。
1987年的春天，當Wiley和他的同事們終於第一次看到了一個MHC分子的三維結構時，其震憾絕對可以說比七年前看到血凝素時有過之而無不及！用一個不太恰當，但是形象的比喻，MHC分子底部是兩個支撐的結構域，頂部的構造像一條小木船，船中的臥槽里躺了一個人。那個「人」就是MHC分子所遞呈的抗原肽段（見附圖球形原子組成的抗原分子「躺在」MHC的一個槽里，面向前來的免疫細胞）。也就是說，MHC分子以一種非常「優雅」的方式把病原體的抗原肽段送到了受感染細胞的表面，供淋巴細胞來識別。它和免疫學家們以前熟悉的抗體分子完全不一樣。這個結構一下子給免疫學家打開了一個全新的研究細胞免疫的思路。淋巴細胞表面的受體TCR既能和外來抗原分子作用，又能和MHC同時發生作用。這很好的解釋了為啥不同個體會對不同病原會有不同反應。個體和個體之間遺傳得到的MHC不同，它們基本結構一樣，但是它們表面分布的胺基酸組成不同，對不同病原體識別能力也就不同。譬如已知有極少數人天然對愛滋病毒有一定免疫性。這保證了整個物種里必定會有一定的個體會有一定的MHC分子可以把任何新冒出來的病原體識別了，遞呈到細胞表面，激發免疫反應。物種得以成活。MHC結構也有助於解釋自身免疫病又是如何發生的，也為個性化醫學鋪了路。等等。MHC結構提供了研究細胞免疫的基石。因此Steve Harrison對MHC的評價，「一個結構改變了一個領域」是中肯的。
「請帶我去一個地方小飯館搓一頓」
我和Don Wiley前後相識有二十年。1981年我剛到哈佛作訪問學者時，他剛剛在Nature上發表了轟動學界的血凝素的結構。但是他給我的印象確是非常隨和的，他會坐在地毯上，很隨便地把蘋果在牛仔褲上噌一噌就啃一口。
Harrison/Wiley 實驗室的傳統是每天四點有一個下午茶，大家喝茶吃點心聊天，Don經常是中心人物，談天說地。要是工作中有有趣的進展，我有時會去敲他辦公室的門，他非常願意我去和他分享，討論。
1996以後我到哈佛醫學院的Dana-Farber 癌症研究所任職，我們的課題有時還會和Wiley發生直接競爭，互有勝負。有一次，我們有一個免疫學上非常有意義的結構比他們先解出來後，我邀請Don到我們實驗室的圖像顯示器上來看結果，他很高興看完後，很快提出幾點擊中要害的生物學見解，令我十分欽佩，因為那正是我思索了好多天後，打算寫文章的要點，讓他一眼就點破了。
1982年9月我完成訪問學者項目後回國，Don告訴我，他11月要到北京參加一個國際病毒學會議。他一再跟我說，一定要帶他去一個地方小飯館搓一頓。
那個時候即便在北京，飯館也不多。我和我夫人想到了比較有北京特色的東安市場，我們三人進了一個大餐廳，只見人山人海，煙霧騰騰，嘈雜喧譁，諾大一個餐廳一個空位子都沒有，我們只好站在一個桌子後面等。那時即便在北京，外國人也極少，Wiley又是一個大高個兒，這唯一的老外站在那裡要多顯眼就有多顯眼，人人都會很好奇地盯他看。半小時後一對夫妻終於吃完了，服務員過來把那張大桌子擦出一個角落來，讓我們三人坐下，美餐一頓。
據說他回到波士頓後，繪聲繪色地給實驗室講了他這次的有趣的，他一輩子都沒有過的經歷。這正是我所認識的Don Wiley 的另外一面。
參考文獻：
[1]Oral history by Harrison, Wiley, Skehel, Wilson, in http://virologyhistory.wustl.edu/
[2]Pamela Bjorkman: Finding the groove, Nature Immunology, 2006; 7: 787
[3]Jack Strominger: The tortuous journey of a biochemist to immunoland and what he found there, Annual Review of Biochemistry, 2006; 24: 1
[4]Wilson IA, Skehel JJ and Wiley DC, Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution, Nature, 1981; 289:366
[5]Bjorkman PJ, et al., Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2, Nature, 1987; 329:506