DNA N6-甲基腺嘌呤（6mA）是原核生物中最普遍的表觀遺傳鹼基修飾之一，最近在多細胞真核生物中被發現。然而，真核生物DNA容易被細菌DNA污染，該細菌DNA攜帶極其豐富的6mA（〜 2％ 6mA / dA）。這在樣品預處理和分析技術方面都給準確檢測真核生物中的DNA 6mA帶來了巨大挑戰。使用靈敏的超高效液相色譜-四重質譜（UHPLC-MS / MS）分析未能在小鼠胚胎干（mES）細胞中檢測到高於背景水平的6mA信號。迄今為止，尋求確鑿的證據以支持6mA在哺乳動物中存在。
2020年4月30日，徐國良及汪海林等人在Cell Research在線發表題為「N6-methyladenine is incorporated into mammalian genome by DNA polymerase」的研究論文，該研究開發的無污染UHPLC-MS / MS技術用於哺乳動物中6mA的超靈敏和準確檢測。該研究在四種培養的哺乳動物細胞系中測量了基因組6mA。同時，該研究發現哺乳動物中DNA N6-甲基腺嘌呤鹼基的新起源（通過DNA聚合酶摻入哺乳動物基因組），這牽涉到這種罕見鹼基在基因組功能範圍內的複雜性。
DNA N6-甲基腺嘌呤（6mA）是原核生物中最普遍的表觀遺傳鹼基修飾之一，最近在多細胞真核生物中被發現。該鹼基可能在逆轉錄轉座子調控中具有表觀遺傳作用。然而，真核生物DNA容易被細菌DNA污染，該細菌DNA攜帶極其豐富的6mA（〜 2％ 6mA / dA）。這在樣品預處理和分析技術方面都給準確檢測真核生物中的DNA 6mA帶來了巨大挑戰。使用靈敏的超高效液相色譜-四重質譜（UHPLC-MS / MS）分析未能在小鼠胚胎干（mES）細胞中檢測到高於背景水平的6mA信號。迄今為止，尋求確鑿的證據以支持6mA在哺乳動物中存在。
這些問題促使研究人員重新研究哺乳動物細胞中的DNA 6mA。為了提供可靠的數據，該研究開發的無污染UHPLC-MS / MS技術用於哺乳動物中6mA的超靈敏和準確檢測。該研究在四種培養的哺乳動物細胞系中測量了基因組6mA。
研究人員在三種人類細胞系中觀察到6mA電流信號，包括HEK293T細胞，人間充質幹細胞和人類胚胎幹細胞（hESC），另外研究人員還在mESC中檢測到6mA。通過特異性PCR分析檢測到，在所有這些培養細胞中均未觀察到支原體污染。通過使用早期的G1期阻滯palbociclib，研究人員觀察到6mA的適度增加，這是第一次報告了G1期中6mA的累積。
接下來，研究人員利用獨特的穩定同位素標記的脫氧腺苷示蹤技術來研究6mA的起源。先前的研究表明[15N5] -2'-脫氧腺苷（[15N5] -dA）示蹤劑可以[15N4] -dA的形式摻入基因組DNA中。如果在任何培養的細胞中都存在依賴於甲基轉移酶的6mA ，應檢測到[15N4] -6mA。儘管對dA進行了有效標記，但該研究未能在包括mESC，hESC和HEK293T細胞在內的三種測試細胞系中所有細胞周期階段檢測到任何[15N4] -6mA信息。此外，在六個培養條件下，該研究沒有在mES細胞的基因組中檢測到任何[15N4] -6mA。為了證實結果，研究人員使用了第二種穩定的同位素標記試劑[13CD3] L-蛋氨酸。該化學物質可在體內轉化為穩定的同位素標記的甲基供體S-腺苷-L-蛋氨酸，必須通過可能的6mA甲基化酶利用它來生成DNA N6-甲基化的腺嘌呤。如果有任何甲基轉移酶作用於dA的N6原子，可以檢測到形成的[13CD3] -6mA。與上述結果一致，研究人員在所有細胞周期階段均未在處理過的mES細胞中檢測到任何[13CD3] -6mA。總的來說，以上所有結果支持觀察到的6mA獨立於甲基化酶，證明了不依賴於甲基化酶的6mA。
現在的問題是mES細胞6mA怎麼整合進基因組。為了回答這個問題，研究人員首先探索了常規使用的高保真Taq DNA聚合酶，以替代哺乳動物細胞中依賴模板的高保真複製聚合酶。通過用N6-甲基-dATP（N6mdATP）取代2'-脫氧腺苷三磷酸（dATP），該研究觀察到6mA摻入PCR產物中。但是，當使用比例為1：1000的N6mdATP和dATP的混合物進行PCR擴增時，研究人員無法觀察到任何6mA摻入。這些結果表明，高保真聚合酶更喜歡使用dATP而不是N6mdATP進行DNA合成。與非同步細胞相比，G1期mES細胞晚期Polλ的mRNA表達增加。Polλ敲低有效降低了非同步和晚期G1期細胞的mRNA表達和6mA豐度。研究人員進一步產生了兩個Polλ基因敲除mES細胞系。研究人員用 L-mimosine處理細胞以獲得G1期占優勢的細胞，並觀察到polλ的缺失降低了6mA的豐度。
為了進一步研究mES細胞中DNA 6mA的起源，研究人員通過CRISPR / Cas9技術敲除了潛在的甲基化酶基因mettl4和去甲基化候選基因alkbh。該研究獲得了兩個mettl4−/−mESC，五個alkbh1−/− mESC和一個alkbh1-/-HEK293T細胞系。顯然，mettl4敲除不能降低mES細胞中6mA的基因組水平。總體而言，這些結果不支持Alkbh1在消除基因組摻入的6mA中發揮作用。
總體而言，該研究數據表明哺乳動物中DNA N6-甲基腺嘌呤鹼基的新起源（通過DNA聚合酶摻入哺乳動物基因組），這牽涉到這種罕見鹼基在基因組功能範圍內的複雜性。
參考消息：
https://www.nature.com/articles/s41422-020-0317-6