編者按：

十年前，有學者發現了一種由脂質構成的細菌導管，其不僅能連接不同種類的細菌，甚至可以連接細菌和哺乳動物細胞，而且有研究提出該導管允許胺基酸和毒素等物質的轉移。但也有人提出這些導管可能是人為污染。那麼這種導管真實存在嗎？

今天，我們共同關注細菌納米管。希望本文能夠為諸位讀者帶來一些啟發和幫助。

全新特徵：細菌納米管

2011 年，微生物界了解到了細菌的一個全新特徵：納米管（Nanotubes）。不久後科學家們還發現，細菌間的這些膜狀中空管狀結構，允許胺基酸和毒素等物質的轉移。

這些管狀結構與科學家們之前見過的都不同，這些納米管是由脂質而非蛋白質組成的。它們比菌毛更混雜，經常能夠聯結不同物種的微生物，甚至能將細菌與哺乳動物細胞相連。細菌納米管看起來似乎是微生物學中長期被忽視的特徵。

捷克科學院的研究生 Jiří Pospíšil 對這些新興的細菌結構非常著迷，因此在他攻讀 RNA 聚合酶方向的博士兩年之後，也就是 2016 年，開始研究納米管。但當開始複製一些首次將納米管可視化的研究時，他很快就碰壁了。

儘管進行了一系列不同的實驗，但他仍然無法再現之前的研究結果。雖然他偶爾會發現細胞之間形成的納米管，但這種情況發生的很少，而且往往只發生在特定條件下。這讓 Pospíšil 對於納米管在微生物界的普遍性和重要性產生了懷疑。

不過 Pospíšil 沒想過要放棄，因此他與斯洛伐克科學院的 Imrich Barák 進行了合作。Barák 可以使用更為複雜的成像技術，Pospíšil 說，他希望能藉此觀察到這種獨特的結構。

利用載玻片和蓋玻片，Pospíšil 和 Barák 共同製備了用於顯微鏡觀察的枯草芽孢桿菌。有一天，他們看到載玻片上的細胞在移動。為了固定這些細胞，Barák 說，「我們就決定將蓋玻片向下壓」。當他們這樣做時，他們看到納米管幾乎從每個細胞中迸發出來。更仔細的觀察之後，Pospíšil 和 Barák 發現細胞正在衰亡。

這一觀察結果發表於 2020 年十月，與所有先前發表的針對納米管的文獻截然相反，因為此前的文獻認為，這種結構是活的健康細胞之間的導管。

Barák 說，如果納米管確實是凋亡細胞的特徵，那麼「這一結構是轉運對於微生物生長和存活所需物質的核心」這一假設就不太可能是真的，「我們意識到，這可能意味著存在著具有不同功能的納米管。」

什麼是細菌納米管？

與很多科學進步一樣，細菌納米管也是偶然間被發現的。2008 年，以色列耶路撒冷希伯來大學的微生物學家 Sigal Ben-Yehuda 和她的研究生當時正在研究枯草芽孢桿菌的孢子形成。

他們其中一個實驗包括了兩種枯草芽孢桿菌的混合物，其中一種表達綠色螢光蛋白（GFP），另一種不表達，在該實驗中，兩種微生物被置於同一環境一起生長。通過光學顯微鏡觀察，他們發現一些原本不表達綠色螢光蛋白的細胞也有微弱的螢光，而且這些細胞與表達綠色螢光蛋白的細胞離得很近。

先前在巴斯德研究院工作的研究人員Bubey說：「我認為，這裡發生了一些不為人知的物質交換。」

為了弄清楚發生了什麼，Ben-Yehuda 和 Dubey 進行了一系列實驗。他們利用另一些螢光小分子（如鈣黃綠素）進行了實驗，發現這些小分子同樣會在細胞間「跳躍」，質粒、RNA 這樣的基因組材料也同樣如此。

細菌可以通過不依賴於接觸的系統（如簡單擴散和囊泡），或是依賴於接觸的系統（如接合菌毛和分泌系統），進行物質交換。但是科學家們觀察到，即便是在那些沒有已知轉運機制的枯草芽孢桿菌中也存在物質交換。Ben-Yehuda 說：「這讓我們想到，可能存在一些我們以前不知道的交換。」

當她和 Dubey 利用高解析度電子顯微鏡觀察枯草芽孢桿菌時，他們看到了細菌延伸到相鄰細胞的管狀結構。Ben-Yehuda 說：「我們可以反覆多次地觀察到它們。」

令人驚奇地是，這一結構從未被報導過。他們翻閱了過去那些論文中細菌的電子顯微鏡圖像，令他們高興的是，他們可以在各種情況下看到這些細菌納米管。Ben-Yehuda 認為這些細菌納米管之所以一直被忽略，是因為沒有人真正意識到它們是什麼。2011 年，該團隊發表了論文，首次報導了用於聯結細菌細胞的細菌納米管的存在。

在細菌納米管被發現之前，人們所知道的唯一能在細菌細胞間轉運物質的接觸性系統是由蛋白質組成的，而且研究人員也發現，這些管道所連接的細胞有著一定的限制，比如接合菌毛僅會在攜帶特定質粒的細菌與攜帶特定受體的細菌之間形成。

Ben-Yahuda 的團隊發現，不像那些以蛋白質為基礎的系統，納米管幾乎都是由脂肪組成的，而且看起來對於它們聯結的細胞也並不挑剔。納米管常常看起來像一系列連在一起的囊泡，它們的長度各異，而且會促進細胞之間的細胞質連接。這種細胞質間的連接恰恰將納米管與革蘭氏陰性菌的膜外囊泡區分開來，後者是用於包裹和分泌物質的結構。

Ben Yehuda 的團隊想了解細菌納米管的分布到底有多廣泛，他們測試了很多種其他的細菌。他們的隔壁是由 Ilan Rosenshine 領導的實驗室，主要研究致病性大腸桿菌（EPEC），這種細菌會依附於宿主細胞上，通過一些不為人知的分子機制來汲取營養。Ben-Yehuda 認為，這種機制可能是納米管。

她與 Rosenshine 聯繫，請他分享一些 EPEC 樣本給她。2019 年，他們共同發表了兩篇論文，其中一篇報導了 EPEC 在依附到宿主細胞時會產生納米管。另一篇則表明，納米管能夠連接革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，而且實現這種連接，細菌需要一組被稱之為 CORE 複合體的蛋白（共 5 種）。缺少這組蛋白的 EPEC 和枯草芽孢桿菌都無法產生納米管。

Ben-Yahuda 說：「我們無法想像，這些不同的系統，從 EPEC 到芽孢桿菌都是一樣的。」

同時，其他實驗室也在他們自己的細菌體系中記錄了納米管的存在。2015 年，德國奧斯納布呂克大學的 Christian Kost 和她的同事們對兩種細菌（大腸桿菌和貝氏不動桿菌）進行了基因改造，使它們分別缺少一種胺基酸，因此它們只有在共同生長並存在物質交換的情況下才能存活。

研究人員利用螢光標誌物標記胺基酸，並使用顯微鏡進行觀察，結果發現，兩種細胞之間的胺基酸在交換。他們追蹤了這些螢光標記物隨時間的運動情況，發現這種交換是通過這種由脂肪組成的管狀結構發生的。利用電子顯微鏡，科學家們隨後確認了這種結構為細菌納米管。

同一年，法國國家科學院和艾克斯-馬賽大學的 Marie-Thérèse Giudici-Orticoni 團隊發表了一篇論文，報導說在丙酮丁醇梭菌（革蘭氏陽性菌）和脫硫弧菌（革蘭氏陰性菌）之間發現了類似納米管的連接。在利用掃描電鏡和其他技術觀察時，他們發現這種細胞間的連接可以讓細胞在嚴苛的生長條件下（如營養缺乏時）進行物質交換並得以存活。

在 2020 年，紐卡斯爾大學的 Jinju Chen 團隊記錄了銅綠假單胞菌中存在納米管，這是一種常見於醫院並能形成生物膜的病原體。

納米柱是一種常用於醫療設備表面，以阻止有害生物膜形成的微小尖刺。面對納米柱時，這種細菌能夠將自己排列在納米柱之間，並利用納米管與其他細胞連接。由於該細菌無法產生其他如菌毛等連接性的結構，因此該團隊確定，他們所看到的這種連結性結構確實是納米管。他們總結說，納米管可能便利了細菌之間的交流，從而促進細胞在適宜的環境中產生生物膜的能力。

考慮到有如此多的實驗室在不同條件下的活躍生長的細胞中，都觀察到了細菌的納米管，因此，Pospíšil 沒想到他做同樣的事情會遇到困難。

難以捉摸的結構

當 Pospíšil 剛開始觀察細菌納米管時，他很快就注意到，這種結構被觀察到的頻率遠比 Ben-yehuda 實驗室所報導的要低得多。Pospíšil 的導師 Libor Krásný 說：「研究納米管最大的挑戰在於，切實地檢測到納米管。」事實上，每掃描 500 多個細胞，他們才能發現一個納米管。

捷克科學院微生物研究所電子顯微鏡團隊的領導 Oldřich Benada 說：「我們『看到』了像納米管一樣的東西，但是頻次非常非常低。而且我們必須要掃描很多畫面才能發現一些這種結構。」他說，他對於納米管到底是否存在抱有懷疑。

在他們探索納米管很多年之後，Krásný 在一次會議中遇到了 Ben-Yehuda，討論了他的團隊在觀察這一結構時所遇到的困難，之後 Ben-Yehuda 給他們提供了一些自己實驗室之前在用的細菌菌株和相關記錄，但是捷克的團隊仍然無法看到納米管。研究人員也進行了嘗試，但並不能夠重現 Ben-Yehuda 的實驗室先前所進行的一些物質交換實驗。

當 Pospíšil 與他斯洛伐克科學院的同事 Barák 無意中壓到載玻片，他們才發現，這會讓細菌產生很多納米管。他們立即開始測試多種壓力值，以探尋哪一種最可能讓細胞產生納米管。他們發現，施加約 80 千帕壓力時，即在蓋玻片上放置一個 2.5 公斤的重物 10 秒，幾乎每個細胞都立即產生許多延伸出去的納米管。

當 Pospíšil 利用一種名為 SYTOX Green 的標誌物（僅會使衰亡中或已死亡的細胞著色）時發現，納米管僅由那些被染綠的細胞產生。這也讓他明白，這種壓力會殺死細胞，最終造成納米管的產生。

考慮到壓到蓋玻片只是一個常規操作，因此，Barák 說，他認為之所以壓力誘導的納米管先前並未被報導，是因為人們們總是習慣忽略已經死亡的細胞。他補充說，在過去幾十年間，給細胞膜染色、壓蓋玻片這種操作中，「我甚至都從未觀察到納米管，因為我們根本不會專注於它們。」現在，他明白了，如果他小心地固定好這些細胞並使用一台良好的顯微鏡，他將很有可能看到納米管。

Barák 說，當該團隊於 2020 年 12 月發表其研究成果後，來自科學界的反響大多是積極的。該論文在推特被廣泛轉發，並收到了一些懷疑納米管是否切實存在的科學家們的評論。

Alex Merz 是華盛頓大學的生物化學家，他曾公開批判了 Ben-Yehuda 實驗室的一些論文，特別是近期的一篇文章。

該文章詳述了 CORE 複合體的作用並表明納米管可以連接革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌。這兩類細菌有著截然不同的細胞被膜，當納米管從革蘭氏陽性菌延伸到革蘭氏陰性菌時，它是只會與革蘭氏陰性細菌的外膜相互作用，還是會與細胞的內層膜相互作用？

Merz 說，他認為要弄清細菌納米管是真實存在的功能性結構，還是人為現象，了解這些問題的答案至關重要。他呼籲使用更高解析度的顯微鏡技術，這可以使得人們更仔細地觀察到納米管是如何與兩種類型的細菌的被膜相連的，而這些技術並未被用於近期的這些論文中。他說：「我需要看到更多實證才能被說服。」

約翰霍普金斯醫學院的生物化學家 Erin Goley 與 Merz 懷有同樣的擔憂。她說：「對於它們是否是真實具有功能的結構，我很懷疑。」除了納米管的組織方式外，她還對納米管看似多面手的特性感到困惑。迄今為止，幾乎所有依賴於連接的系統都有著自己嚴格的調控機制，而令 Goley 感到奇怪的是，納米管似乎缺少這種調控。

與 Merz 相同，她也希望能夠看到納米管更高質量、跨區域的圖像，特別是在它們與細菌細胞的連接之處。Goley 和 Merz 都推薦的這種技術可以幫助科學家們減少在傳統制樣過程中發生的人為污染，並使得細胞維持其原本的狀態，這有利於「展現出這些薄膜上實際發生的現象——是什麼連接了什麼，哪些膜與哪些物質所連接。」Goley 說。

Kost 說，他認為，Czech 的團隊所看到的壓力誘生的納米管可能表明了脂質從死細胞中爆發出後的自我組織（self-organization），這與一項過去的研究相似。該研究中表明，原初生命體是一種能夠與周圍環境相互作用的自組織脂質囊泡，在一定條件下可以形成長的脂質管。

他補充說：「我認為，在某種情況下細胞的確會出現這種現象。但是這很顯然不能排除納米管可能在活細胞中有一定作用。」

Ben-Yehuda 的團隊支持這一研究，該實驗室的博士後 Amit Baidya 說：「我們並未將細胞置於任何壓力之下。」Ben-Yehuda 也指出，他們觀察到的細菌菌落在產生納米管後仍然能夠生長、分裂。

但是，即便是在她的實驗室，研究人員有時候也需要很努力地觀察納米管。主要的挑戰在於缺少納米管的標籤，這迫使科學家們必須依賴於膜染色而且往往會生成許多干擾的圖像。

Ben-Yehuda 說：「就像是看太陽之後嘗試看一些非常微小的事物。」Baidya 認為，鑑定納米管的過程需要仔細對待。「制樣時，你必須非常非常小心，」他說，「如果你某天不夠專注，或是非常著急，你都不會看到納米管。」

為什麼難以重複？

關於細菌納米管的研究在許多方面都存在差異，包括使用的菌種或菌株、生長條件、檢測物質交換的方法以及使得這些結構可視化的顯微鏡技術。而且，就像 Pospíšil 的研究所指出的，不是所有的實驗室都能在所有條件下成功發現納米管。

哈佛醫學院光學顯微鏡設備主管 Paula Montero Llopis 說，已知溫度、酸度和空氣等生長條件，都會影響細胞生理學和外觀的因素。比如說，枯草芽孢桿菌會以兩種形式呈現：能夠自由移動的遊動孢子，以及由與其他細胞連接的無法移到的細胞鏈。

Montero Llopis 的工作已經表明，在低溫的含有酪蛋白水解物（胺基酸來源）的培養基中，細胞更容易形成後一種形式。她表示：「我發現遊動孢子與鏈狀結構的數量分布很大程度上由培養細胞的方式所決定。」

在研究納米管時，Pospíšil 和 Kost 都使用了液體培養基，而 Ben-Yehuda 的實驗室則使用固體瓊脂培養皿來培養細菌。Pospíšil 和 Kost 都未能觀察到固體培養基中細菌的納米管，而 Ben-Yehuda 也沒觀察到液體培養基中的細菌納米管。

Kost 將不同的實驗結果歸因於每個實驗室所研究的細菌種類不同：Ben-Yehuda 的實驗室研究的枯草芽孢桿菌是一種土壤細菌，傾向於在固體表面成長，而 Kost 實驗室研究的大腸桿菌則更「喜歡」液體培養基。

Kost 指出，即便是嘗試複製另一些實驗室的研究，最終的比較結果也會很詭異。而且，當他的實驗室從一所大學搬到另一所大學後也面臨著同樣的問題，「我們嘗試儘可能地複製我們用過的所有材料，但是誰知道是否真的很好地複製了呢？」Kost 解釋說，不只是不同供應商提供的產品有所差異，即使是使用相同供應商的材料來培養細菌或者進行細菌成像，不同批次的化學試劑也會對實驗的重複性造成阻礙。

這些差異同樣存在於科學家們在進行細菌成像前的準備工作以及所使用的成像技術中。

當製備用於電子顯微鏡觀察的細菌樣品時，最常見的兩個步驟就是晾乾細胞並噴金。Merz 說：「這些技術……可能是非常粗獷的，它們確實會帶來很大的人為污染的風險。」

他也提醒道，應當避免使用化學方法固定，這種技術利用多聚甲醛等化學物質在一定時間內「冷凍細胞」，因此更有可能出現人為污染。同樣是利用電子顯微鏡觀察納米管，不同的實驗室所使用的成像技術和制樣技術也可能差異很大。

對於懷疑納米管是否真實存在的人來說，觀察納米管時所需的不同的（甚至有時候相反的）條件是不容忽略的。Ariane Briegel 是萊頓大學超微結構生物學教授，她認為這些在電子顯微鏡中觀察到的結構事實上很可能是乾燥過程中的人為污染，這也是為什麼它們不能持續被觀察到。

她表示：「我確實相信，在細胞之間存在物質交換，但是對於納米管是否真實存在，我並不確信。」她補充說，缺乏可重複性只會更增加她的懷疑。

但是對於 Kost 來說，很多條件下都會產生納米管，這便是證明它們真實存在的證據。「我發現，令我們備受鼓舞的是，有很多實驗室都報導了非常非常相似的現象。」

事實上，納米管這種顯而易見的存在促使他繼續向前。2019 年，她的團隊發現，通過納米管進行的胺基酸運輸是單向的——細菌 A 產生的納米管可以將物質從細菌 A 轉移到細菌 B，但反過來則不行。這表明，納米管具有控制作用，而不僅僅是連接兩個細胞的細胞質的管道。

Kost 說，他的實驗室正在進行的研究表明，納米管可能不只是傳遞者，而且也是細菌協同作用的關鍵促進者。他說，在未發表的文獻中，該實驗室發現，納米管的存在會讓細胞選擇相互協同而非競爭。「這完全改變了我看待生態學相互作用的方式。這一切看起來似乎在暗示，這些納米管是協同進化的關鍵。」

同時，Ben-Yehuda 的團隊也在繼續揭露納米管形成的細節。最近，研究人員發現，產生納米管的細菌首先會向受體細胞發送水解酶的激活劑，這種激活劑可以誘使細胞壁重塑讓納米管洞穿，並通過其傳送物質。

Ben-Yehuda 說，同時，細胞看起來也在以某種方式來為納米管的排布提供導向。「它們可以在空間內的任何地方生長，但是它們總是直接朝著對方生長。這讓我認為並非偶然。」

Pospíšil 在瀕亡細胞生出的納米管中並未觀察到這種導向型，但是他觀察到，納米管在區域內的產生有著一定的傾向。在垂直伸長的枯草芽孢桿菌細胞中，Pospíšil 觀察到，納米管主要從細胞的兩端（頂部和底部）產生，而不是從細胞的兩側產生。

開放科學中心的研究主管 Tim Errington 指出，出現相反的結果並不總是不好的。「在科學領域，存在不同的觀點正是你想要的，因為你並非只需接受你所說的那些事情……你必須要不停地回顧它們。」

Ben-Yehuda 並未對 Pospíšil 的發現感到不安，並且對探索關於細菌納米管的無數未解問題感到興奮。「多年來，我們確信它們是真實存在的，儘管有些人認為它們並非如此。科學是一場馬拉松，我們的研究就是跑一場馬拉松，而非短跑。」

原文連結：

https://www.the-scientist.com/features/what-s-the-deal-with-bacterial-nanotubes-68780

作者｜Sruthi S. Balakrishnan

編譯｜C。