快訊｜中國學者首發新冠病毒無症狀感染組免疫學特徵和蛋白標誌物

論文導讀

近日，上海交通大學瑞金醫院呼吸與危重症學科瞿介明教授、瑞金醫院上海血研所諸江教授，和時任上海公共衛生臨床中心的盧洪洲教授等多個研究團隊合作，在國家轉化醫學中心（上海）陳賽娟院士及印彤研究員團隊的支持下，在國內頂級期刊Cell Research （2021 Impact Factor = 25.617）發表研究論文，首次揭示可區分持續無症狀（persistently asymptomatic）和潛伏期無症狀（presymptomatic）感染者的特異性免疫學特徵和蛋白生物標誌物。

本研究使用質譜流式細胞分析、單細胞轉錄組學和Olink血漿蛋白組學等多組學技術手段，對新冠病毒感染靜默期（Silent SARS-CoV-2 Infection Stage, SSIS）進行系統性人群隊列研究，首次發現了可區分潛伏期和持續無症狀感染者的特異性免疫學特徵，發現並驗證了可用於臨床早篩的「潛伏期無症狀感染者」蛋白生物標誌物STC1和MMP-1，這一發現可以幫助克服核酸檢測無法區分上述兩種無症狀感染者給感染者早期診療和疫情防控帶來的難題，為對新冠肺炎在臨床上更早發現潛伏期無症狀感染者，並對其進行及時干預、阻斷其進展為確診患者提供了理論基礎和轉化契機。

原文：https://www.nature.com/articles/s41422-021-00562-1

筆者感悟：

✦ 「多維度多組學」可助科學家更好地發現免疫學特徵；

✦ Olink血漿蛋白組，因其基於免疫學方法，易於跟ELISA等其他臨床現有免疫學方法進行互相驗證，以加速科研成果的臨床轉化；

✦ 對於核酸檢測無法區分的病人群體（例如文中的持續無症狀感染者和潛伏期無症狀感染者），可藉助蛋白生物標誌物等其他組學工具進行有效區分。

研究背景

據WHO統計數據顯示，全球新冠肺炎確診病例已超過2.3億人，死亡病例超過472萬人，新冠疫苗接種針劑已達587萬。但隨著COVID-19病毒的不斷進化突變和目前檢測僅局限於RT-PCR核酸檢測，在新冠病毒感染靜默期的人群在無新冠臨床症狀的情況下無法得到及時區分，導致持續無症狀感染者僅在核酸報告陽性轉陰性時方可確認為隱形無症狀感染者，而潛伏期無症狀感染者在進入急性肺炎階段才能得以確診並進行臨床干預。而流行病學數據進一步顯示，靜默期的無症狀感染者占新冠肺炎的主要傳播源，占比75.9%。

Resource from https://covid19.who.int/

新冠病毒感染人體後會產生廣譜免疫學反應，而這些正是影響疾病發展進入免疫防禦和病症惡化的主要因素。儘管對於急性肺炎階段已有比較明確的免疫學應答指標以評價疾病進展，如單核細胞和巨噬細胞非正常激活、刺激性緊急骨髓細胞生成和T細胞/B細胞過度激活導致部分免疫功能耗竭等。對於靜默期疾病進展早期階段的免疫應答，目前仍是知之甚少。因此，在本論文中，研究團隊致力於發現在靜默期起相反決定作用的細胞/分子免疫應答因素，更全面的了解新冠病毒感染後人體免疫系統的特定防禦機制和病原傳播機制，以發現針對無症感染者更快、更合適的干預及治療手段。

研究流程及數據分析

研究團隊對入組的五組人群，包括健康組/隱形感染組/潛伏期感染組/輕症患者/重症患者的臨床樣品進行了系統的臨床隊列研究，採用質譜流式細胞技術和單細胞轉錄組學對患者外周血單核細胞（Periphera Mononuclear Blood Cell，PMBC）進行細胞水平免疫應答研究，同時採用Olink蛋白組學平台對血液樣品中的180個蛋白標誌物進行分子水平免疫學研究。

研究團隊通過臨床症狀和血清學數據比對分析，發現針對Spike蛋白的IgG和IgM抗體滴度在潛伏期感染人群中升高。質譜流式細胞分析顯示，靜默期人群中，B細胞激活頻率上升；而NK細胞在靜默期和急性感染人群中都被頻繁激活；同時與持續無症狀感染組相比，潛伏期患者的細胞免疫學指標有可見變化（雖無統計學差異），如CD161hi NKT cell (T15)上升；CD62Lhi CD8+ Tnaïve (T04)下降；CD8+ TEMRA上升等。以上細胞免疫學分析數據暗示潛伏期患者在靜默期存在T細胞耗竭風險。

通過單細胞轉錄組學研究進一步發現，單核細胞特異激活和分化發育遲緩，可見於潛伏期感染者，如淋巴細胞中CD44升高和PD-1下降；總單核細胞頻率下降，如CD107alo C、MoI-Mo和NC-Mo等。

瑞金醫院轉化醫學國家研究中心（Olink認證合作中心實驗室）研究團隊在對入組人群血樣，採用Olink超多重高靈敏蛋白組學平台，對血漿中的180種蛋白標誌物進行了多維度免疫炎症學系統性表徵。發現潛伏期感染組血漿中STC1表達水平下降，並伴隨單核細胞和淋巴細胞異常。

Olink蛋白組學分析數據進一步發現，在靜默期和急性期都有出現和淋巴細胞及骨髓細胞相關的多種免疫炎症指標的可見變化：與正常組相比感染陽性組， T細胞和NK細胞相關的部分趨化因子上升，包括TNFSF14、CCL20、CXCL10和CXCL11；同時，介導單核細胞分化和激活的關鍵調節因子也有顯著上升，包括MCP-1/CCL2、MCP-2、MCP-3 和EN-RAGE。如同預期，抗病毒天然免疫應答相關的細胞因子在靜默期和急性期都被檢出，包括CASP-8、CCL11、 TRIM5、 IRAK1、CD40、 IL8、 IRF9 和 DDX58，顯示人體免疫系統已被激活。

Olink血漿蛋白組學分析數據顯示，有7個免疫炎症因子包括4個單核細胞相關因子（MMP-1、CLEC4A、LY75 和 STC1），在持續無症狀感染組和潛伏期無症狀感染組有明顯區別，且與潛伏期感染者單核細胞過度激活相關。在潛伏期感染組，對比健康組MMP-1上升最為顯著；對比持續無症狀感染組NC-Mo激活及遷移相關的MMP-1陰性調節蛋白STC-1的表達量顯著下降；同時，與單核細胞功能相關的DLEC4A和LY75都明顯下降。以上研究證據都顯示，STC-1在潛伏期人群轉急性感染階段起著重要作用。

多組學隊列研究發現兩組免疫學特徵可區分潛伏期和持續無症狀感染者

可能是由於靜默期SSIS相關參數之間的干擾，單一技術平台的數據（多重流式細胞、單細胞轉錄組和血漿蛋白組）都無法通過PCA聚類分析區分潛伏期和持續無症狀感染者。研究團隊進一步將多組學數據進行整合分析，引入免疫細胞學相關的基因分組後，包括I型INF響應通路中巨噬細胞分化激活相關的6個基因；單核細胞功能及炎症通路相關的10個基因後，在靜默期SSIS人群中，有7個血漿蛋白組學生物標誌物呈現顯著變化，可區分潛伏期和持續無症狀感染者。與預期一致，基於基因分組的兩個維度，通過PCA聚類分析可發現30個因素組合用於區分潛伏期和持續無症狀感染者。以上研究進一步驗證了，在複雜疾病機制及臨床隊列研究中，從多個維度進行多組學研究應用的重要性及必要性。

最後，基於Olink血漿蛋白組學結論，研究團隊又進一步通過酶聯免疫ELISA技術，對發現的兩個重要的單核細胞相關標誌物STC1和MMP-1，做了進一步驗證。ELISA結果在之前的第1隊列研究和全新的第2組隊列研究中，都與Olink血漿蛋白學有很好的一致性，STC1和MMP-1標誌物可在靜默期SSIS中將潛伏期感染者和持續無症狀感染人群區分開來。

研究總結

文中研究團隊致力於新冠病毒感染靜默期SSIS無症狀感染人群，運用「多維度多組學」方法進行系統性人群隊列研究，首次發現細胞水平和分子水平特異性免疫學特徵，可區分持續無症狀感染者和潛伏期無症狀感染者；並針對潛伏期感染者在感染靜默期的免疫機制進行了系列研究，發現導致靜默期SSIS兩種相反疾病進展的免疫機制；最後，通過Olink血漿蛋白組和ELISA平台發現並驗證STC1和MMP-1兩個蛋白標誌物可顯著區分潛伏期無症狀感染者；以上研究數據為對新冠肺炎在更早期進行診療提供了理論基礎和轉化契機。

Olink Proteomics

（納斯達克代碼：OLK）

Olink Proteomics創立於瑞典烏普薩拉，致力於突破蛋白檢測在「多重能力/特異性」、「靈敏度」和「檢測通量」等方面的綜合瓶頸，進而實現超靈敏多重蛋白標誌物檢測、無偏靶向蛋白質組學和精準蛋白組學，以幫助蛋白標誌物的發現、藥物研發、轉化醫學、以及讓「多組學整合」真正切實可行。

具體來說，我們基於專利PEA技術，秉承嚴謹和透明的科學精神，開發並充分驗證了一系列開創性的Olink Panel。

這些Panel可賦能科學家，通過在1-8µl體液中精確檢測48-3072種生物標誌物，更加充分地理解實時生物學。從而，藉助多組學發現pQTL等創新藥物靶點；篩選更好的疾病預測和預後標誌物；理解藥物作用的MoA, Safety, PK, PD, Dose；拓展已上市藥物的適應症；開發伴隨診斷；加速藥物研發進程，降低藥物研發成本；同時促進從臨床科研到臨床應用的轉化；提高腫瘤等疾病早篩方法的靈敏度和特異性，並最終達致精準醫學。

Olink現已覆蓋100%主要信號通路，實現生物學意義上的超靈敏無偏靶向蛋白組學（兼容各種樣本類型，對傳統方法無法勝任的血漿血清等體液樣本尤其適用）。