隨著LC-MS技術的進步，治療性蛋白表徵的糖基化修飾分析研究領域已獲得長足進展，這是生物類似藥比較不可或缺的部分。重組治療性蛋白的糖基化修飾因其在穩定性、體內活性、溶解性、血清半衰期和免疫原性方面發揮著重要作用被視為一種關鍵屬性。
中國食品藥品檢定研究院採用超高效液相色譜質譜聯用方法(UPLC-MS)，對中國兩家生產商的兩種市售rhEPO生物藥物原料藥進行了全面的比較分析，開發了一種能常規監測rhEPO產品糖基結構變化的有效工具，因為這些變化有可能導致rhEPO產品在免疫原性、半衰期和療效方面的差異。研究成果已公開發表，證明所用UPLC-MS分析方法是一種可行工具，能夠評估全球市場上不同市售rhEPO產品的差異，並重點關注了中國市場的相關需求。今天小編與大家一起研讀學習。
01rhEPO產品間的糖型整體特徵比較
圖1. Intact mass analysis of rhEPO analogues by reversed-phase UPLC and ESI-MS for structural assessment（圖A, B）。
圖1A所示為兩種rhEPO類似物的UPLC-MS譜圖。如圖1A中的單個寬峰所示，rhEPO樣品的糖型特徵似乎比較複雜。儘管未見rhEPO蛋白質異構體有明顯的色譜分離，但進一步的檢查表明，根據唾液酸（帶負電荷的糖）數量和游離寡糖大小，採用UPLC時略微分離了EPO各糖型。當採用反相(RP)色譜技術或其他基於疏水性的技術時，rhEPO異構體的分離較難實現，因為這些異構體為結構相關的分子種類，各異構體間僅有細微差異。各種糖型的UPLC分離度總體欠缺，所以在完整蛋白質水平上的批量分析轉而採用高分離度的MS技術。
圖1B所示為兩種rhEPO類似物（EPO A和EPO B）的原始質譜，所有色譜峰的MS掃描（範圍為4.8-5.8 min）均有合併，並通過基線扣除進行了處理。有一系列代表多重質子化離子的譜峰，m/z範圍為1500-2700。初看這些譜圖似乎十分複雜，因為它們確實包含了大量的結構信息。譜圖複雜性來源於兩個主要因素：1.通常與電噴霧電離相關的多個電荷態；2.游離寡糖異質性。對於上述樣品，電荷態的範圍為12+ - 18+，並在譜圖上進行了標記。
圖2. Intact mass analysis of rhEPO analogues by reversed-phase UPLC and ESI-MS for structural assessment（圖C, D, E）。
對於EPO A和EPO B樣品，強度最高的電荷態均為15+和16+。如果檢查單電荷態，則可觀察到多個離子，表示rhEPO樣品的不同糖型。去卷積質譜圖顯示在27,000和32,000 Da之間有許多譜峰，如圖2C所示。一個rhEPO分子至多可以擁有14個唾液酸（每三個N-糖至多4個，每單個O-糖至多2個），部分游離寡糖的複雜性與這些分子的唾液酸化程度不同相關，唾液酸的數量在11-14之間。大多數這些離子都可能歸為蛋白質骨架(18235.7 Da)，寡糖部分則與Hexn-HexNAcn-3-Fuc3-Neu5Ac11–14（n的範圍為16-24）的總組成相對應。這些發現與相關報告一致，即rhEPO上的N-糖由岩藻糖基化的雙天線、三天線和四天線複雜游離寡糖組成，唾液酸化程度較高，而O-糖具有Gal-GalNAc雙糖核，末端具有一到二個唾液酸。為了推斷在相鄰峰簇上的游離寡糖歸屬情況，將相鄰峰之間365 Da的質量差異歸因為增加了Hex-HexNAc基團，相當於增加了一個臂或一個乳糖胺延伸結構；而656 Da的差異則歸因為增加了一個臂或一個具有Neu5Ac末端的乳糖胺延伸結構。圖2C中有大量代表rhEPO糖型的MS譜峰，還有許多MS峰簇。這些峰簇彼此相關，主要差異在於一個或兩個單糖，或者其他修飾。
總體而言，整體譜圖包括了若干個峰簇重複。圖2D顯示了主要離子和某些豐度較低的離子（譜峰處於一個簇中）。譜圖該區域的基峰質量數與Hex22HexNAc19Fuc3Neu5Ac11的所有游離寡糖總的單糖組成相對應。研究推斷，儘管還無法排除存在其他糖型與這種總組成相匹配，但是這種糖型可能含三個岩藻糖基化的四天線N-糖（無LacNAc連接）、一個O-糖和總共11個Neu5Ac單糖。主峰和位於+42 Da處的衛星峰表明某些唾液酸存在O-乙醯化。高於約16 Da質量數的小峰與主峰並未完全分離，這可歸因為存在Neu5Gc或在蛋白質部分中存在蛋氨酸氧化（根據肽圖分析數據，這種推斷不太可能成立）。由於幾乎所有峰都可能根據游離寡糖部分的質量數有對應歸屬，所以因蛋白質骨架修飾而造成的影響似乎微乎其微。
總體而言，譜圖其他峰簇中MS峰的注釋相似。原始和去卷積完整蛋白質量數分析數據顯示，EPO A和EPO B的糖基化分布存在明顯差異。與EPO A相比，EPO B樣品顯示的分子量分布更寬且高分子量分子更多。為了區分EPO B中存在更多高分子量分子是因為更多的唾液酸化作用，還是因為更高程度的支鏈化或更多延伸的N-糖結構，對兩種rhEPO類似物均採用唾液酸苷酶進行了處理，以將唾液酸從N-糖和O-糖中去除。對去唾液酸化rhEPO樣品進行完整蛋白質量數分析。結果表明，兩種rhEPO類似物在去唾液酸化後的糖基分布十分相似，提示EPO B的更多高分子量分子是因為更高水平的唾液酸化所致。該結論還可通過游離寡糖數據得到印證，即本研究觀察到EPO B中的高度唾液酸化結構比EPO A中的更多。這些結果表明該方法具有適用性，可對rhEPO樣品的糖基化異質性進行總體表徵，並可以儘可能少的樣品處理來評價產品質量。
02rhEPO產品間的O-糖型特徵比較
因為O-糖是rhEPO整體糖型特徵的一部分，所以有必要了解其模式以及rhEPO O-糖是如何導致EPO A和EPO B的整體差異的。採用PNGase F處理rhEPO樣品去除N-糖，只留下O-糖結構作為與蛋白質連接的唯一游離寡糖後，對O-糖型進行了分析。圖2E所示為EPO A和EPO B在N-糖基釋放後的完整質譜。該圖顯示的信息十分詳細，可以找出rhEPO的各個MS峰的歸屬。由於rhEPO分子在Ser126處僅有一個O-糖基化修飾位點，所以該特徵顯示在該位點存在O-糖基化修飾的微異質性。兩個豐度最高的MS峰的去卷積質量數分別為18895.4 Da和19186.7 Da，與具有三糖(Hex-HexNAc-Neu5Ac)和四糖(Hex-HexNAc-Neu5Ac2)作為O-糖連接結構的N-糖基釋放rhEPO一致。
原始數據顯示：對於EPO A和EPO B而言，含兩個唾液酸的O-糖型(EPO A：58.3%; EPO B: 55.9%)的豐度高於單唾液酸化糖型(EPO A：36.5%; EPO B：36.8%)，而且在O-糖上均有鑑定出唾液酸的O-乙醯化，即EPO A(O-糖的整體O-乙醯化：16.6%)和EPO B(O-糖的整體O-乙醯化：23.2%)。此外，對完整譜圖的檢查表明，存在與O-糖基化修飾（質量數18238.8 Da）相關的無糖基化rhEPO(1.6%和6.4%)。儘管在兩種樣品中均觀察到18254.8 Da處（質量數高出16.0 Da）的峰，但是大多數峰似乎是PNGase F酶解期間蛋白質骨架氧化所致，而非存在Neu5Gc的緣故，這一點也通過游離N-糖分析實驗得到了驗證。
與測定游離寡糖和糖蛋白酶解物相比，完整糖蛋白的糖型測定具有諸多優勢，例如節省時間和減少樣品處理流程（操作人員和樣品處理對結果的影響更小）。雖然這種方法可以提供質量屬性的全面概覽信息，但若查看更詳細的信息，仍需要採用其他如基於肽圖分析和游離寡糖分析的方法。這一點在Hex22HexNAc19Fuc3Neu5Ac11的總糖基組成上體現得十分明顯。該組成的原因可能在於：有兩個含Hex7HexNAc6Fuc1Neu5Ac3組成的N-糖；與牛津命名系統中的F(6)A4G(4)4S3相對應，有一個含Hex7HexNAc6Fuc1Neu5Ac4 (F(6)A4G(4)4S4)組成的N-糖，還有一個含Hex1HexNAc1S1組成的O-糖。或者，N-糖可能是Hex6HexNAc5Fuc1Neu5Ac3 (F(6)A3G(4)3S3)、Hex7HexNAc6Fuc1Neu5Ac3（可能為F(6)A3G(4)3Lac1S3）、Hex8HexNAc7Fuc1Neu5Ac4（最有可能為F(6)A4G(4)4Lac1S4），以及含Hex1HexNAc1S1組成的O-糖。第三種可能性是：含Hex5HexNAc4Fuc1Neu5Ac2 (F(6)A2G(4)2S2)組成的N-糖、兩個含Hex8HexNAc7Fuc1Neu5Ac4 (F(6)A4G(4)4Lac1S4)組成的N-糖以及一個含Hex1HexNAc1S1組成的O-糖。所有這些可能性得到的總的單糖組成均相同。儘管如此，與第一種可能性相比，第二種可能性增加了乳糖胺延伸結構的量，同時減少了A4糖基的量；而第三種可能性雖然減少了A4糖基的量，但卻增加了具有乳糖胺延伸的A4糖基的量。乳糖胺延伸可能是需要監測的重要關鍵質量屬性，今後也可能是通過游離寡糖分析監測的可靠屬性。與之相比，完整蛋白質量數分析方法則提供了有關完整rhEPO分子的高水平概覽信息，能定性定量描述rhEPO多肽鏈上的所有PTM，但仍依賴於其他方法進行驗證，從而強調了要獲得全面可靠的表徵需要進行多種實驗。肽圖分析數據表明，除了N-糖基化修飾和O-糖基化修飾外，在多肽骨架上不存在主要PTM。因此，通過完整蛋白質量數分析可能觀察到的rhEPO整體蛋白質異構體或異質性主要歸因於三個N-糖基化修飾位點和一個O-糖基化修飾位點處的糖基化修飾。
03rhEPO肽圖分析
EPO產品的主要胺基酸序列已通過UPLC-MSE肽圖分析實驗進行了驗證。除了胺基酸序列的確證以外，這些數據還可用於準確定位修飾位點（這無法通過完整蛋白質量數分析實現），這些修飾位點可能是由處理引入的，也可能是通過實驗引入的，包括焦穀氨酸鹽生成、蛋氨酸和色氨酸氧化、天冬醯胺脫醯胺和非特異性/非酶促糖基化。另外，如糖基化等生物PTM也可通過本方法進行分析。在本研究中，利用了MSE的數據非依賴型採集方法。該方法為在低能量掃描(6 V)和高能量掃描（範圍為20-45 V）之間交替，採集完整肽母離子數據及其碎片離子數據。由於未選擇肽母離子，所以所有生成的離子均為碎片離子，從而得到的是有效且信息豐富的碎片離子數據（將至少三個碎片離子作為肽鑑定的標準）。由於這是一種「動態」方法，並未選擇肽母離子，所以這種方法仍可定量，而且先前已經證明了其在肽圖分析實驗方面的助益。為了確保儘可能減少因共洗脫造成的不確定性，採用了擴展梯度，並得到了在基線分離的所有肽。通過擴展梯度實現的分離也使得對不同樣品實施比較評估更加方便。
雖然許多肽圖分析實驗利用的是胰蛋白酶，但本研究採用的是賴氨醯肽鏈內切酶(Lys C)。內源性EPO的C端胺基酸殘基為精氨酸，儘管研究報告rhEPO的生物藥物產品沒有該末端殘基，但仍通過胰蛋白酶將其去除。因此，為了確保這些樣品的末端沒有精氨酸，賴氨醯肽鏈內切酶是一種更加合適的酶。賴氨醯肽鏈內切酶的酶解顯示，含有蛋白C端的K9肽末端具有天冬氨酸殘基。對於任何一種rhEPO樣品，均未檢出任何類似物的末端具有精氨酸。賴氨醯肽鏈內切酶產生了九種不同的肽，其已採用相關標準鑑定，被判定為有效肽（質量精度在預期值的2.5 ppm範圍以內，且至少具有3個一級碎片離子）（參見圖3）。
圖3. LC-MSE chromatograms from the peptide mapping experiments of EPO A and EPO B digested by Lys-C. The assignment of each chromatographic peak is based on the accurate precursor mass measurement (<2.5 ppm) and the corresponding fragment ions generated in the high energy MSE data channel.
在兩種樣品中，發現了同樣的九種肽。對於生物藥物EPO，這九種肽的預期胺基酸序列的序列覆蓋率為99%。僅有單個二肽（K8：LK胺基酸序列）未能鑑定。利用這些數據，對各種關鍵質量屬性進行了研究，包括天冬醯胺脫醯胺、蛋氨酸和色氨酸氧化、N-糖基化修飾位點驗證以及O-糖肽圖分析。在rhEPO中存在六個天冬醯胺殘基，其中三個(N24、N38和N83)為N-糖基化修飾位點，而且在任一樣品的N24、N38和N83上均未鑑定出無糖基化位點。因此，僅有三個天冬醯胺(N36、N47和N147)可以自發脫醯胺，即不通過酶法去除N-糖。在20 h賴氨醯肽鏈內切酶/18 h PNGase F的協同酶解後，兩種EPO樣品的N47和N147處均觀察到有自發脫醯胺，且每個位點自發脫醯胺水平非常相似。對於預期的肽序列和其脫醯胺類似物，生成了所有觀察電荷態全部同位素的提取離子流圖，並進行積分。隨後，用脫醯胺物質的峰面積除以預期序列的峰面積。計算完成後，兩種樣品中N47的比率分別為3.8%和4.0%，N147的比率則分別為7.6%和8.3%。
研究認為，大多數的自發脫醯胺與酶解過程相關，因為兩種樣品在2 h賴氨醯肽鏈內切酶酶解後的N47比率均為0.4%，在4 h酶解後的比率均為0.7%。對於N47，兩種樣品在2 h酶解後的N47比率分別為0.5%和0.6%；對於N147，在4 h酶解後一種樣品的比率為1.0%，另一種樣品的比率則為1.2%。因此，很有可能天然蛋白質中的脫醯胺水平非常低，即對於N47和N147而言，比率分別小於0.4%和0.6%。在N36處，未見脫醯胺。對於rhEPO，僅存在單個蛋氨酸和三個色氨酸殘基，其都有可能被氧化。再次創建並積分提取離子流圖，將肽和氧化蛋氨酸的積分峰面積比率除以預期肽的峰面積比率。計算完成後，所得比率數值為12.6%。然而，由於蛋氨酸位於其中一個N-糖肽(N83)中，所以無法測定在2 h Lys C酶解或4 h酶解(2 h後添加PNGase F)後的數值，因為該肽在2 h PNGase F酶解後並無糖基釋放。此外，該肽還含有兩個無法氧化的色氨酸殘基(W64和W68)，研究進一步觀察到該肽具有一個或兩個氧化水平較低的色氨酸殘基。研究並未嘗試測定色氨酸的氧化水平，因為其僅見於含有氧化蛋氨酸的肽骨架上。在W51處，未見色氨酸氧化。
04N-糖分析
為了評估這項主要關鍵質量屬性，採用了一種速度快、靈敏度高的方法對N-糖進行了分析。在該方法中，N-糖由於其糖胺僅在5 min內就可釋放。接著，採用快速標記試劑(RapiFluor-MS)對氨基進行標記，研究顯示，該試劑能提升FLR和MS的性能。隨後，通過HILIC-UPLC/FLR-MS對標記N-糖進行分析，並藉助UNIFI科學信息系統採用游離N-糖分析工作流程進行處理（FLR + MS確證）。雖然已根據歐洲藥典EPO標準開發了用於RFMS標記游離寡糖的GU資料庫，但是該蛋白質並不含有任何具備O-乙醯化唾液酸特徵的游離寡糖。
因此，為了開展本研究，開發了一個自定義資料庫。為了開發這個資料庫，通過分析RFMS標記的葡聚糖校準曲線標準品，藉助UNIFI計算了每個色譜峰的GU值。通過精確質量數數據和MSE碎片離子數據，測定了每個峰的組成。因此，在許多情況下，游離寡糖以組成形式報告，原因是尚未測定唾液酸鏈，在某些情況下，多重O-乙醯化唾液酸的結構仍有不確定性。例如，含兩個O-乙醯基的雙唾液酸化游離寡糖可能在每個唾液酸上都含一個O-乙醯基，也可能在單個唾液酸上含兩個O-乙醯基。儘管如此，在某些情況下，MSE數據仍能顯示更加確切的結構。例如，對於在m/z 1141.092處觀察到的三電荷離子組成（圖4），根據精確質量數數據，測定的初始組成為F(6)A3G(4)3S3/OAc2，這是含兩個O-乙醯基（表示為「/OAc2」）的岩藻糖基化三天線/三唾液酸化游離寡糖，其中假定兩個唾液酸為單O-乙醯化修飾。然而，MSE數據檢測表明組成為F(6)A3G(4)3S2SOAc(2)1，這種岩藻糖基化三天線/三唾液酸化游離寡糖的兩個唾液酸並非O-乙醯化修飾，而是其中一個唾液酸為雙O-乙醯化修飾。「OAc」後面的數字「(2)」表示單個唾液酸上的兩個O-乙醯基。MSE譜圖在m/z 657.233處的高強度離子支持存在這一組成（參見插圖圖4），即Gal-GlcNAc-S碎片。假如具有兩個單O-乙醯化游離寡糖，那麼在m/z 699.244處應存在高強度離子，表明存在Gal-GlcNAc-S/OAc碎片。經觀察，與該碎片對應的離子的離子強度非常低。儘管如此，在m/z 741.258處觀察到強度很高的離子，而該離子與Gal-GlcNAc-SOAc(2)相關，其中兩個O-乙醯基均與單個唾液酸連接。因此，從上述數據來看，我們認為該游離寡糖的組成應該為F(6)A3G(4)3S2SOAc(2)1。
圖4. MS/MS spectrum for the triply-charged ion at m/z 1141.092, elucidating a probable glycan structure of F(6)A3G(4)3S3/OAc(2)1 for the ion. The inserted figure showing the intense ion m/z 657.233 supports the conclusion that the Gal-GlcNAc-S fragment bears two O-acetylation groups.
採用本分析工作流程，兩種樣品游離寡糖譜圖的可比性非常高，如圖4所示。第一種樣品具有33個經質量數確認的游離寡糖，第二種樣品則有32個經質量數確認的游離寡糖。關於質量數確認，要求實測質量數在計算質量數的5 ppm範圍以內。對於這兩種樣品，最主要的游離寡糖為F(6)A4G(4)4S4，其他豐度更高的游離寡糖為具有1~3個乳糖胺延伸和3或4個唾液酸的四天線（在本研究所用命名中以A4表示）結構。在本研究中，僅觀察到具有N-乙醯神經氨酸末端的游離寡糖，未檢出含N-羥乙醯神經氨酸的游離寡糖。對於這兩種樣品，所有經質量數確認的游離寡糖均存在岩藻糖基化和唾液酸化的情況。
圖5. Annotated fluorescence (FLR) chromatograms from the HILIC-UPLC/FLR-MS analysis of rhEPO analogues, depicting the N-linked glycans derived from the EPO A (top) and EPO B (bottom). In total, 33 glycans were mass confirmed for EPO A and 32 glycans for EPO B.
在rhEPO中有多種重要的N-糖屬性需要監測，包括游離寡糖高度支鏈化（A4型）的程度、具有乳糖胺延伸的游離寡糖含量以及含O-乙醯化唾液酸的N-糖水平。為了比較每種屬性的水平，對體現相應屬性特徵的每種游離寡糖含量百分比進行了匯總。如圖5中的匯總情況所示，EPO A的A4游離寡糖水平略低於EPO B，分別為65%和近74%。若僅考慮具有乳糖胺延伸的A4游離寡糖，則EPO A（約31%）的這類游離寡糖含量百分比仍會略低於EPO B (37%)。對A4游離寡糖和具有乳糖胺延伸的游離寡糖水平進行監測具有重要意義，因為這兩類游離寡糖可增加該蛋白質的穩定性並影響其血清半衰期。
對於rhEPO而言，需要監測的一項重要N-糖特徵是唾液酸的O-乙醯化水平。O-乙醯化會阻斷唾液酸酶活性，防止去除該單糖並延長EPO的血清半衰期。EPO A具有18個含O-乙醯化唾液酸的N-糖，EPO B中則發現了16個這類游離寡糖。若對含O-乙醯化唾液酸的每種游離寡糖含量百分比進行匯總，則第一種樣品的O-乙醯化唾液酸水平為21.8%（圖5），第二種樣品的水平為16.1%。對於這兩種樣品，豐度最高的含O-乙醯化唾液酸的游離寡糖為F(6)A4G(4)S3SOAc1，經測定，兩種樣品中該游離寡糖的含量百分比不足6%。
圖6. Abundance levels of various N-glycan attributes. The values were calculated by summing the normalized abundance levels (see Supplemental Table III for details) for each glycan that possesses a given attribute. The percentage of O-acetylation refers only to N-glycans.
結論
- 本研究利用幾種互補的分析工具對中國生產的rhEPO產品分子結構進行了表徵。上述分析的合併結果提供了關於rhEPO分子的深度結構信息，從而使對中國市場上的rhEPO產品開展結構相似性評估成為可能。對於可能出現在rhEPO肽骨架上的潛在PTM（非N-糖基化修飾），肽圖分析數據提供了相關的詳細信息；然而，對於在rhEPO上的關鍵PTM（N-糖基化修飾），肽圖分析方法尚未涵蓋，游離N-糖分析則提供了相關的補充信息。通過肽圖分析方法和游離N-糖分析獲得的信息又有助於更好地理解/解釋完整蛋白質量數分析數據，這提供了有關分子異質性的全貌。
- 本研究的主要部分重點關注了EPO類似物的游離寡糖分析，因為糖基化修飾對所觀察到的結構差異有很大影響。對於游離糖基分析，採用了一種集成工作流程，該流程結合了新近報告的RFMS游離寡糖標記試劑和預先構建的歸一化HILIC-UPLC保留時間游離寡糖資料庫，前者可提升游離寡糖的UPLC-MS分析性能，後者可自動化完成糖基鑑別並獲得準確的MS數據，以供進行質量數確認。該分析工作流程的核心是游離寡糖資料庫。主庫開發採用通過嚴格結構表徵研究獲得的真實實驗數據，相關研究藉助了外切糖苷酶陣列酶解和精確質量數測定技術。輔庫開發針對的是含O-乙醯化唾液酸的游離寡糖，並以精確質量數作為基礎，因為唾液酸O-乙醯化可抑制唾液酸酶活性，所以這類游離寡糖能耐受進一步的外切糖苷酶陣列酶解。本信息學工作流程提供的方法可鑑定複雜混合物中單個游離寡糖，並可藉助FLR數據定量比較不同樣品的游離寡糖譜圖。因此，本分析工作流程可用於監測上市以及尚在開發的rhEPO產品的產品質量屬性是否發生變化。這一能力通過本研究所分析的兩種不同樣品得到了充分體現。
- 本研究所用方法顯示兩種樣品具有幾點共性：兩種樣品中的游離寡糖均高度唾液酸化、大多數唾液酸均呈O-乙醯化結構，而且兩種樣品中的幾種N-糖天線均具有N-乙醯乳糖胺單元延伸。同樣重要的是，本方法可以顯示某些關鍵結構差異。例如，EPO A的A4游離寡糖水平(65%)略低於EPO B（近74%）。若僅考慮具有乳糖胺延伸的A4游離寡糖，則EPO A（約31%）的這類游離寡糖含量百分比仍會略低於EPO B (37%)。這些數據突出了對生物藥物中糖基化修飾監測的必要性，特別是對於身處生物類似藥時代的人們，糖基化修飾監測可有力確保持續的安全性和療效。已有報告指出，通過CHO細胞生產的生物治療藥物糖蛋白可能攜帶少量潛在有害的游離寡糖表位，如N-羥乙醯神經氨酸，其會引起人體內的非預期免疫原應答。採用本研究所述的這類方法對新開發的和現有rhEPO產品的糖基化修飾進行密切監測，將為此類產品的安全性和療效提供可靠保證。
參考文獻
William Alley Jr , Lei Tao , Henry Shion , Ying Qing Yu , Chunming Rao , Weibin Chen. UPLC-MS assessment on the structural similarity of recombinant human erythropoietin (rhEPO) analogues from manufacturers in China for attribute monitoring. Talanta. 2020 Dec 1;220:121335.