據世界衛生組織報導，2015年全球約有2.57億慢性HBV感染者，每年約有88.7萬人死於HBV感染相關疾病。我國HBsAg陽性率仍高約為6.1%，占全世界病例的1/3，每年因HBV導致的肝硬化和肝癌死亡30萬~50萬例，每年與B型肝炎直接相關的醫療負擔高達6000億元[1]。因此，慢性B型肝炎(CHB)仍是我國亟待解決的嚴重公共衛生問題。
CHB的治療目標是延緩或減少肝硬化失代償、肝衰竭和肝細胞癌的發生，從而改善患者生活質量和延長生存時間，HBsAg陰轉與肝功能、組織病理以及長期預後改善相關[2-3]。目前臨床常用的治療CHB的藥物主要有核苷(酸)類似物和IFN。核苷(酸)類似物主要通過競爭性抑制HBV DNA多聚酶的活性直接抑制HBV DNA的複製，其優勢體現在強效、快速抑制病毒複製，改善肝組織炎症和壞死，但其不足之處在於HBsAg清除率低，HBeAg血清轉換率也比較低，需要長期治療且停藥後容易復發，長期應用會發生耐藥變異[4]。而IFNα是有限療程的抗病毒藥物，主要通過增強免疫細胞功能和促進細胞因子的表達、誘導IFN刺激基因的產生並經IFN信號通路編碼多抗病毒蛋白等環節作用於HBV複製、轉錄等重要生物學過程，從而發揮免疫調節和抗病毒的雙重作用[5-6]。此外，IFN還可通過增強HBV前基因組RNA (pgRNA) 和核心顆粒的降解，或通過對cccDNA的表觀遺傳修飾來抑制HBV轉錄並減少病毒蛋白如HBsAg的表達，停藥之後可實現持久免疫控制病毒，不易復發[7]。既往研究[8]表明，CHB患者接受IFN治療後，約8%的患者可產生HBsAg陰轉或血清學轉換(臨床治癒)，這是抗HBV治療的最理想的療效，核苷類似物治療難以達到類似效果。
既往循證醫學證據證明基於IFN有限療程的治療相較於核苷(酸)類似物可獲得更好的持續病毒學、生化學、血清學應答，改善肝組織學，減慢向肝硬化、肝癌的進展[9-10]，但由於宿主和病毒等因素的差異，IFN治療的療效不一。目前臨床上已有相關的文獻報導[11-13]提出使用聚乙二醇干擾素α (PEG-IFNα) 治療CHB患者，基線的宿主和病毒因素如：女性、年輕、HBV基因型A或B亞型、低病毒載量及較高ALT水平等均預示著良好的應答。此外，治療期間HBsAg、HBeAg和HBV DNA的水平有助於臨床醫生決定是否繼續或停止PEG-IFNα治療[14]。近期有研究[15]認為HBV新型標誌物: B型肝炎核心相關抗原(HBcrAg)和HBV RNA也是預測PEG-IFNα治療應答的有效預測因子。
目前有相關的研究認為IFN刺激基因(ISG) 與HBV及PEG-IFNα治療B型肝炎相關。IFN能誘導的ISG數量極為龐大, 儘管多年來已經鑑定出許多ISG, 但只有部分ISG的抗病毒活性和相關機製得以闡明, 絕大多數ISG的相關生物學和抗病毒作用機制還有待於深入探索，ISG對療效的預測了解仍較少。因此，本文主要綜述ISG與B型肝炎的關係、其相關的抗病毒作用及對IFN治療CHB患者的預測作用。
1ISG的誘導產生
既往研究表明，IFN主要分為3類，分別為IFN-Ⅰ、IFN-Ⅱ和IFN-Ⅲ。其中，IFN-Ⅰ和IFN-Ⅲ與其受體IFNAR1、IFNAR2等結合後，其各自受體上的酪氨酸激2 (TyK-2) 與Janus激酶-1(JAK-1)相互靠近結合發生磷酸化而被激活，隨後進一步活化信號轉導及轉錄激活因子(STAT)1、STAT2，被磷酸化的STAT1和STAT2與IFN調節因子9 (IRF-9) 結合形成異源三聚體-IFN調節因子3 (ISGF3)，ISGF3入細胞核與ISG調節元件(ISRE) 結合，激活ISG轉錄。而IFN-Ⅱ受體IFNGR-1、IFNGR-2的胞內域分別與Jak1和Jak2激酶結合，激活Jak1、Jak2，並磷酸化STAT1、STAT2，隨後活化形成同源二聚體GAF (IFNγ- activated factor)，併入核與GAS (IFNγ-activated sequence)結合，誘導ISG的轉錄[16](圖1)。
圖1 IFN級聯信號通路激活ISG
註：3種不同類型的IFN信號通過與細胞表面不同的受體結合激活胞內通路發揮作用。IFN-Ⅰ和IFN-Ⅲ分別與其受體IFNAR1、IFNAR2和IL-10R2、IFNLR1結合後，其各自受體上的TyK-2與JAK-1相互靠近結合發生磷酸化而被激活，隨後進一步活化STAT1、STAT2，被磷酸化的STAT1和STAT2與IRF-9結合形成異源三聚體ISGF3，ISGF3入核與ISRE結合，激活ISG轉錄。IFN-Ⅱ受體IFNGR-1、IFNGR-2的胞內域分別與JAk1和JAk2激酶結合，激活JAk1、JAk2，並磷酸化STAT1、STAT2，隨後活化形成同源二聚體GAF，併入核與GAS結合，誘導ISG轉錄。
ISG作為由IFN誘導表達的基因，在宿主抵抗病毒感染的過程中發揮著至關重要的作用。越來越多的研究表明，ISG能夠靶向病毒複製的不同階段(包括病毒入侵、脫殼、基因組複製、病毒粒子裝配以及釋放等環節)，進而抵抗病毒感染，但由於ISG成員眾多，且各自的結構及其在細胞中的定位也各不相同，這決定了ISG在宿主體內以不同機制來發揮抗病毒作用(圖2)。
圖2 ISG在病毒生命周期靶向作用目標
註：ISG蛋白干擾病毒生命周期的不同階段。膽固醇-25-羥化酶(CH25H)可能在宿主膜融合事件期間早期影響病毒入胞; 黏液瘤抗性蛋白1 (MX1)通過阻斷傳入病毒顆粒的內吞運輸和核糖體核衣殼的脫殼而抑制多種病毒; 干擾素誘導跨膜蛋白(IFITM)成員抑制廣譜病毒內吞融合事件; TRIM5α參與抑制人類免疫缺陷病毒1 (HIV-1) RNA的脫殼; 一些ISG通過降解病毒RNA和/或阻斷病毒mRNA的翻譯來抑制病毒，如人體2′-5′寡聚腺苷酸合成酶(2′-5′OAS)家族、蛋白激酶(PKR)、鋅指抗病毒蛋白(ZAP)等; TRIM22抑制病毒的轉錄、複製或病毒蛋白質運輸到質膜; ISG15抑制病毒翻譯、複製或胞吐，如蝮蛇已被證明能抑制病毒複製或病毒在質膜上出芽。Tetherin將成熟的病毒顆粒誘捕到質膜上，從而抑制病毒的釋放，並廣泛作用於許多包膜病毒。
2ISG的抗病毒作用
2.1 抑制病毒入胞
抗黏液病毒蛋白1 (MX1) 是最早發現的抑制病毒入胞的效應分子，主要在早期阻止病毒的複製[16]。CH25H可以將膽固醇轉化為羥基膽甾醇(25HC), 25HC可通過阻斷病毒和其他寄生體細胞間的膜融合反應進而影響病毒入胞, 也可在病毒感染的早期發揮抗病毒作用，並能同時被Ⅰ型和Ⅱ型IFN上調錶達[17]。干擾素誘導跨膜蛋白(IFITM)[18]是一類小分子同源蛋白家族, 對多種病毒產生抵抗，病毒感染機體後，IFN分泌增加並激活Jak-STAT信號通路誘導其表達上調，隨後IFITM蛋白家族通過抑制病毒與寄生蟲細胞膜的相互融合，抑制病毒內吞噬進入細胞, 進而可以抑制病毒的複製反應過程, 不同的IFITM家族蛋白對不同的病毒表現出不同的抑制能力，如IFITM1比IFITM3更顯著地抑制冠狀病毒與線狀病毒的複製等[19]。
2.2 抑制病毒複製、轉錄、翻譯、翻譯後修飾
(1) 蛋白激酶(PKR)由IFN-Ⅰ和IFN-Ⅱ誘導表達，是一種雙鏈RNA依賴性蛋白激酶，被病毒dsRNA等激活後發生自我磷酸化，隨後PKR磷酸化細胞翻譯起始因子2a(EIF2a)，不僅能抑制病毒翻譯，還能調控細胞自身以及病毒所誘導的自噬發揮抗病毒作用。PKR還可通過磷酸化激活NF-κB, 上調IFN發揮抗病毒作用[20]。(2)鋅指抗病毒蛋白(ZAP)：ZAP是哺乳動物體內的一種抗病毒蛋白，該蛋白能夠有效地抑制多種RNA病毒(如反轉錄病毒、甲病毒以及線狀病毒等)的複製[21]。(3)IFIT家族蛋白：主要包括4個家族成員IFIT1、IFIT2、IFIT3及IFIT5，能夠調節轉錄起始、細胞增殖與細胞遷移等多種生命活動。其中IFIT1與IFIT2能夠通過與真核起始因子3 (eIF3) 相互作用抑制翻譯複合物的形成，從而抑制翻譯的起始[22]。IFIT家族蛋白不僅能夠通過影響翻譯複合體的形成來影響RNA翻譯，還可能直接與RNA相結合從而發揮抗病毒作用[23]。此外，除了抑制病毒的轉錄翻譯，ISG還可通過其介導的蛋白翻譯後修飾發揮抗病毒功能。如ISG15在被IFN誘導的E1、E2、E3泛素連接酶活化後，可以共價結合病毒和宿主蛋白進行類泛素化修飾，影響病毒的複製與感染[24]。
2.3 抑制病毒出胞
骨髓基質細胞抗原2 (Tetherin) 是IFN-Ⅰ誘導產生的能夠與病毒囊膜相結合的跨膜蛋白, 其具有特殊的拓撲結構，使病毒錨定在細胞膜上, 在病毒出芽過程中通過細胞質膜上的兩個跨膜區捕獲病毒粒子來抑制病毒的有效釋放, 也對眾多包膜病毒具有抑制作用[25]。蜂蛇毒素(Viperin蛋白)是一種抗病毒蛋白，是極少數自由基sam依賴酶之一，可被JAK-STAT通路誘導和IRF3直接激活表達，對多種包膜病毒具有抑制作用，能夠有效抑制病毒釋放的抗病毒蛋白[26]。另外，最近的一項研究[27]表明，Viperin還可以直接與IFN基因刺激因子(STING)發揮相互作用和增強TBK1的激活，從而增強Ⅰ型IFN反應，進一步抑制HBV的複製。
3ISG介導的免疫調控
ISG不僅具有廣譜的抗病毒作用，還可調控IFN誘導的免疫應答，包括正向增強機體細胞的病原體識別檢測能力和負向調控IFN信號通路。
3.1 正向調控IFN免疫應答
隨著對病原體相關分子模式(PAMP)和模式識別受體(PRRS)的認識，發現病毒侵入細胞後，通過Toll樣受體(TLR)和RIG-1樣受體(RLR)對病毒核酸等病原體的特徵分子進行識別，進而激活一系列的下游信號轉導分子，最終誘導細胞轉錄因子的激活或IFN等效應蛋白的產生。機體的其他信號傳導蛋白如PKR、維甲酸誘導基因1等可被IFN刺激高表達，增強機體對病原識別和檢測能力，同時ISG可以增強IFN的免疫應答信號[16]。常見的具有正調控功能的ISG包括OAS，PKR，IRF3、7、9及STAT1/2等。
3.2 負向調控IFN免疫應答
部分ISG可通過抑制IFN介導的下游信號通路負向調控IFN免疫應答。泛素特異性蛋白酶18 (USP18/UBP43)是泛素化特異性蛋白酶家族成員之一，是ISGl5的特異性水解酶，USP18通過競爭性與IFNAR2亞基結合，進而抑制JAK1與IFNAR2結合，進一步抑制IFN-Ⅰ誘導的Jak-STAT信號通路發揮抵抗IFN的抗病毒治療[28]。細胞因子信號抑制物(SOCS)可被IFN正向調節表達，但SOCS的過表達又可以抑制IFN通路的Jak的磷酸化及STAT的活化[29]。
4與HBV感染相關的ISG及其對IFN治療CHB的預測作用
IFN基因刺激蛋白是調節肝臟內環境的一種重要先天胞質環狀二核苷酸傳感器, 可通過特異性T淋巴細胞應答和自噬等激活IFN調節因子(IRF) 3/IRE7，發揮抑制CHB、肝纖維化和肝細胞癌的作用。IFN治療CHB的療效在不同個體之間差異很大，目前已有相關研究表明ISG可能與HBV感染後的轉歸及抗病毒療效有關，可作為IFN刺激後產生的效應因子直接發揮抗病毒作用。接下來對目前已經報導的與HBV感染相關的ISG及其對IFN治療CHB的預測作用的相關文獻進行綜述。
4.1 SAMD家族
Wang等[30]近期進行的一項研究, 將強力黴素(DOX)控制的表達NTCP的質粒穩轉到HepG2肝癌細胞系中，挑選出其中一個對HBV病毒株(血清學分型ayw，基因型D)感染高度敏感的克隆HepG2-2B1細胞系，然後向HepG2-2B1細胞轉染了285個應答IFN刺激的ISG，加入HBV感染細胞15 d後收集細胞，檢測上清中HBeAg水平以反映HBV的感染水平。研究發現，大部分ISG對HBV複製的影響不大，只有SAMD4A、IDO1、PML、ZAP、ISG20、MYD88、DDX3和ZBP1抑制了HBeAg表達，可能是發揮抗HBV功能的ISG，其中SAMD4A對HBV的抑制作用最強。作者又檢測了HBV感染後不同時間點的HBeAg與HBsAg水平，證實SAMD4A的確抑制了HepG2-2B1細胞中病毒蛋白的產生，但對NTCP的表達沒有影響。在HepG2-2B1細胞中過表達SAMD4A同樣抑制了HBV複製。根據上述結果，作者篩選出了一個具有強效抗HBV能力的ISG-SAMD4A。但目前SAMD家族其他相關基因與HBV感染及IFN治療CHB的相關性的相關研究仍甚少，需要進一步深入挖掘。
4.2 TRIM家族
TRIM蛋白家族，即三結構域(TRIM)蛋白家族，既往對人類及小鼠TRIM家族表達模式分析的研究發現，該家族中部分基因如TRIM5、TRIM19、TRIM22和TRIM25等受IFN誘導表達上調。當病毒入侵後，被激活的IFN應答通路將誘導及上調TRIM蛋白的表達。其中TRIM-α入胞後可直接結合在病毒衣殼蛋白，抑制病毒RNA脫殼。TRIM的表達是對IFN刺激的反應，是控制病毒感染所必需的。
研究表明TRIM家族中的一些基因可抑制HBV的複製，如TRIM14招募泛素特異性蛋白酶14切割賴氨酸(Lys)48連接的泛素鏈，可促進Ⅰ型IFN信號的激活，抑制p62介導的cGAS自噬降解，並在Lys-365處經歷Lys-63連接的多泛素化，並向MAVS信號體募集NEMO，激活IRF3和NF-κB通路，從而增強先天免疫應答。Tan等[31]的研究發現TRIM14通過阻斷DDB1-HBx-Smc複合物的形成抑制HBV複製。TRIM22被證明能抑制HBV核心啟動子的活性，並與體外IFN治療的良好反應相關[32]。由Ⅰ型IFN以IL-27依賴的方式誘導的TRIM25，則被證明通過促進IFN的產生抑制HBV複製[33]。近期，Tan等[34]進行的一項研究，以高通量雙分子螢光互補篩選確定HBx蛋白與145個ISG之間潛在的相互作用，發現7個與HBx相互作用的ISG對HBV複製具有顯著的抑制作用，其中TRIM5γ通過促進k48連接的泛素化和HBx蛋白在k95泛素位點上的降解來抑制HBV複製。在過表達條件下，TRIM5γ的B-Box域足以觸發HBx降解，並負責與HBx相互作用和招募TRIM31，TRIM31是一種觸發HBx泛素化的泛素連接酶。TRIM5γ在IFNa治療的HBV患者中高表達，可能表明有更好的治療效果。該研究確定了TRIM5γ和TRIM31在促進HBx降解方面的關鍵作用。但朱海珍等[35]研究則表明，TRIM28通過抑制JAK-STAT信號通路中ISG的產生促進HBV的複製，在B型肝炎患者肝組織中TRIM28的高表達可能與HBV的慢性感染有關。綜上所述，TRIM家族可能是HBV療法的潛在目標，但並非所有ISG均有抑制病毒複製。
4.3 腺苷脫氨酶(ADAR)
作用於RNA的腺苷脫氨酶(ADAR)家族通過將腺苷轉化為肌苷的作用，可調節多種病毒的複製。ADAR家族有3個成員: ADAR1、ADAR2和ADAR3，其中，作用於RNA-1的ADAR1已知參與了多種病毒的複製。最近的研究發現，在HBV培養模型中，ADAR1的過表達降低了HBV RNA。通過IFNα刺激誘導ADAR1也能降低HBV RNA水平，而敲除內源性ADAR1表達會增加HBV RNA水平。miRNA-122，一種主要的肝細胞特異性microRNA，被發現與ADAR1的表達呈正相關，外源性miRNA-122降低了HBV RNA和DNA，相反，轉染miRNA-122抑制劑則使HBV RNA及DNA升高，該研究首次證實ADAR1通過增加肝細胞內miRNA-122的水平，對HBV感染起抗病毒作用[36]。但Yuan等[37]研究表明，ADAR1可通過其脫氨酶結構域促進HBV複製。Li等[38]研究表明，IFNα刺激ADAR1通過RNA編輯下調線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)的抗病毒作用在HepG2.2.15細胞和2個小鼠模型中得到證實，也證實了CHB患者的MAVS基因多態性與IFNα治療應答的相關性。ADAR1通過人抗原R (HuR)介導的轉錄後調控抑制MAVS的表達，在體內外均表現出抗病毒活性，降低HBV標誌物水平。以上研究均表明，ADAR1與HBV的感染相關。
4.4 泛素特異性蛋白酶18 (USP18)
USP18是泛素特異性蛋白酶家族成員之一，與IFNAR2亞基結合，抑制JAK1與IFNAR2結合，進而抑制IFN-Ⅰ誘導的Jak-STAT信號通路。Liu等[39]進行了一項研究，該研究共納入44例接受IFN治療的HBeAg陽性的CHB患者，結果顯示，無論是病毒學應答(VR)還是血清學應答(SR)，無應答者的USP18IFN-N基線顯著高於應答者。多變量分析顯示，基線USP18IFN-N是VR(OR=0.292，P=0.022)或SR(OR=0.173，P=0.031)新的獨立預測因子。基線USP18IFN-N水平與病毒學和血清學反應相關，並有可能成為HBeAg陽性的CHB患者使用IFN治療的療效預測因子。
4.5 人體2′-5′寡聚腺苷酸合成酶(2′-5′OAS)家族
OAS家族有4個成員OAS1、OAS2、OAS3、OAS-L。既往研究表明，OAS家族的基因多態性與IFN治療CHB的療效相關。Domagalski等[40]近期進行了一項研究，共納入52例接受IFNα治療48周的HBeAg陰性CHB兒童，對OAS1 (rs1131476)、OAS2 (rs1293747)、OAS3 (rs2072136)、OASL (rs10849829) 中的單核苷酸多態性進行了研究，比較了這些患者在治療後24周隨訪中獲得部分緩解(PR：HBV DNA＜2000 IU/ml或ALT＜40 U/L)和完全緩解(CR：HBV DNA＜2000 IU/ml和ALT＜40 U/L) 的情況，結果顯示：OAS-L rs10849829的AA基因型在非CR組中更為常見(P=0.044，OR=0.26，95%CI: 0.07~0.88)。單倍型分析揭示了PR和CR與OAS單倍型之間的顯著關聯。OAS家族基因多態性也可能是一個新的關於IFN治療CHB的重要影響因素。
4.6 細胞識別的鱗狀細胞癌抗原(SART1)
SART1是一種具有特異性E3泛素化連接酶活性的U4/U6.U5 tri-snRNP特異性因子，可調節細胞增殖，有可能作為腫瘤治療的靶點[41]。最近的研究[42]發現，SART1通過增強HCV細胞的ISG表達而發揮抗病毒活性，但其在HBV中的作用尚不明確。Li[43 ]等進行的一項研究共納入33例初治的HBeAg陽性的CHB患者，給予每周注射PEG-IFNα 180 mg治療，共48周。所有接受IFNα治療的患者在基線和治療12周採集血液樣本與PBMC，在IFN治療前24 h採集肝活檢樣本。該研究發現，IFN治療前應答組患者肝臟和PBMC中的SART1基礎表達量明顯高於無應答者。此外，基線SART1表達水平與IFN治療後HBV DNA水平和HBeAg水平下降呈正相關。在HepG2細胞中，沉默SART1抑制了IFNα的抗病毒活性，降低ISG(Mx、OAS、和PKR)的表達，並減弱了JAK-STAT信號，提示SART1通過JAK-STAT信號和ISG的表達調節IFN介導的抗病毒活性。因此，SART1可能為IFN治療CHB提供新的突破點。
4.7 干擾素刺激基因20(ISG20)
ISG20是一種20 kDa的蛋白質，具有3′-5′外切酶活性，能切割單鏈RNA和DNA，可抑制多種病毒的複製，包括HBV、HCV、HIV和登革熱病毒等。Liu等[44]研究表明，ISG20的表達處於基礎水平的肝細胞使用IFN處理後，可使ISG20的表達顯著上調。而下調ISG20則HBV複製增加，IFN介導的抗病毒作用減弱，並表明ISG20通過直接結合病毒RNA的epsilon莖環結構抑制HBV複製。Imam等[45]表示，ISG20通過選擇性降解N6-甲基腺苷修飾的HBV轉錄物抑制HBV的複製，這種效應受到m6A閱讀蛋白YTHDF2的嚴格調節。同時，Park等[46]在HepG2和HepG2-NTCP細胞中檢測ISG20的異位表達來分析HBV的生命周期，發現ISG20顯著抑制HBV複製，並降低了HBV基因的表達和轉錄，這種作用主要通過降低病毒增強子活性來抑制HBV複製，特別是結合增強子Ⅱ和核心啟動子(Enh Ⅱ/Cp)區域抑制HBV增強子活性。因此，ISG20與IFN治療CHB的抑制作用相關，也可以作為一個治療切入點並可能預測療效。
5總結和展望
目前有較多IFN治療CHB的預測指標，包括病毒和宿主相關因素，但預測效能不一。以上相關文獻研究表明，IFN可以通過誘導ISG產物、調節機體的免疫反應及直接作用於感染病毒的增強子/啟動子序列等方式來實現其強大的抗病毒性能。同時，ISG在IFN治療B型肝炎時發揮一定的抗病毒作用，ISG表達水平及活性可能用於IFN抗病毒治療效果的預測，特別是USP18、TRIM家族等研究較多。但IFN能誘導的ISG數量極為龐大，目前只有很少數的ISG已經明確了與B型肝炎的抗病毒活性相關，絕大多數ISG的相關的生物學和抗病毒作用機制仍有待於深入探索。此外，目前仍未有統一的預測IFN治療CHB療效的預測模型，且ISG被證明與IFN治療B型肝炎療效相關的研究尚少且基本為基礎研究，需進一步開展相關臨床研究驗證，以建立更優效的預測系統，識別更多的IFN優勢人群達到更好的療效，為臨床工作提供更深入的指導。
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http://www.lcgdbzz.org/cn/article/doi/10.3969/j.issn.1001-5256.2022.01.031
引證本文
練韻文, 鄭杏容, 吳和維, 等. 干擾素刺激基因抗HBV感染的研究進展[J]. 臨床肝膽病雜誌, 2022, 38(1): 180-186.
本文編輯：林姣
公眾號編輯：邢翔宇
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