水分測定方法開發研究大起底，乾貨滿滿

水分是重要的質量指標之一，水分含量過高過低都影響著藥品食品的品質與質量，無論在質量與經濟效益上都起到至關重要的的作用。同樣，水分含量高低對微生物的生長及生化反應有著密切的聯繫，所以水分測定結果至關重要。產品含量結果計算需要水分數據支持，樣品水分需要給產品保存運輸提供數據支持，一個準確合格的水分值，離不開分析研究人員的基本功檢測能力和檢測儀器設備支持以及對檢測儀器的熟練使用。

中國藥典四部收載的水分測定方法有5種，分別為：卡爾費休法、烘乾法、減壓干 燥法、甲苯法、氣相色譜法；中國藥典一部（中藥）水分測定方法主要是烘乾法（約占99.2%）、甲苯法（約占0.8%）；藥典二部（化學藥）水分測定方法基本都是卡爾費休法。從檢測成本與耗時經濟性考慮，其中卡爾費休法是5種方法中經濟和效率性價最高；同樣在有明確的檢測分析條件與參數，而卡爾費休法（容量法、庫倫法）需要研究的項目都較後4種方法要多。

本篇文章主要講解卡爾費休法，主要涉及原理概述、方法開發與研究、檢測流程優化研究與操作規程、故障與問題分析解決。

一、先把原理搞懂！

1、卡爾·費休水分測定法是以甲醇為介質，以卡氏液為滴定液進行樣品水分測量的一種方法。此方法操作簡單、準確度高，廣泛應用於醫藥、石油、化工、農藥、染料、糧食等領域。尤其適用於遇熱易被破壞的樣品，不僅測出自由水,也可測出結合水。終點判定方法有目測法和電位法兩種。

卡爾費休試劑是一種測定某些物質中微量水份用的試劑，其主要成分有：I2 ，SO2 ，C5H5N，CH3OH。卡爾費休法是非水滴定法，所有容器都需乾燥；假如卡爾費休試劑在配製和保存過程中若入水，試劑就會失效（超過6g/L含水量）。

2、水分滴定原理：卡爾費休法屬碘量法，其基本原理是利用碘氧化二氧化硫時，需要一定量的水參加反應：I2 +SO2 +2H2O→2HI+H2SO4。卡爾費休試劑因含有I2 而顯棕色，當I2， SO2 ，H2O反應後，I2 棕色褪去。此法以棕色出現為滴定終點。

上述反應是可逆的。當硫酸濃度達到0.05%以上時，即能發生逆反應。如果我們要想實際讓方程按照一個正方向進行，需要往反應體系中加入適當的鹼性物質以中和反應過程中生成的酸（氫碘酸、硫酸）。在反應體系中加入吡啶，這樣就可使反應正方向（向右）進行。大量實驗證明，吡啶是最適宜的試劑，同時吡啶還具有可與碘和二氧化硫結合以降低二者蒸氣壓的作用。

3C5H5N+H2O+I2+SO2→2HI·吡啶+硫酸酐·吡啶 生成硫酸酐吡啶不穩定，能與水發生反應，消耗一部分水而干擾測定，為了體系穩定正常向正方向反應，體系中可加入無水甲醇，反應如：硫酸酐·吡啶+CH3OH（無水）→甲基硫酸·吡啶

3、解決辦法：加入甲醇可避免副反應發生，因此，試劑必須加進甲醇或另一種含活潑OH基的溶劑，使硫酸酐吡啶轉變成穩定的甲基硫酸氫吡啶。

總反應式：I2+SO2+H2O+3吡啶+CH3OH→2氫碘酸吡啶+甲基硫酸吡啶

二、方法開發研究

卡爾費休方法開發主要內容：信息收集、容量與庫倫比較、開發主內容。

（1）API水分檢測方法：費休氏-容量滴定法、費休氏-庫倫滴定法

（2）中藥材水分檢測方法：烘乾法、甲苯法

（3）製劑水分檢測方法

1、信息收集

（1）樣品儲存方式和樣品分類；

（2）首先要確定待測物質的溶解性、理化性質、化學結構、穩定性；

①溶解性：這裡的溶解性首先要考慮「脂溶性」，因為費休氏-容量滴定法、費休氏-庫倫滴定法、氣相色譜法3種方法都要樣品溶解處理；

②理化性質：樣品是否具有「引濕性或吸濕性」 ，樣品熔點信息，pH 值等；

③化學結構：具體指水分子在樣品中存在形式，如：游離水、結晶水；另外還要確 認樣品化學結構是否含有其他特殊「醛/酮」結構。

④穩定性具體指熱穩定性，是否受熱分解。

（3）其次還需要確定樣品中是否含有揮發性成分（主要是中藥材）。

（4）確認樣品實際含水量，確認樣品的經濟價值，主要用來方法開發作依據。

（5）方法開發原則：樣品易灰化的採用卡爾費休法、穩定的採用乾燥法。

2、KF容量法與KF庫倫法溶劑組成對比（方法關鍵）

（1）含吡啶滴定劑優點：價格低廉及生產工藝簡單而仍然廣泛應用；含吡啶的卡爾費休試劑比不含吡啶的溶液較穩定，不容易分層，而且有些樣品含吡啶的溶解效果會比較好；含吡啶的卡爾費休試劑有利於反應向正方向發生；含吡啶的卡爾-費休試劑終點的突 變較明顯，反應終點容易判斷。（2）含醛酮結構樣品：醛(R-CHO)和酮(R-CO-R)與通常的含甲醇試劑反應生成縮醛和 縮酮，反應中產生的水同時被滴定，從而導致水分含量升高甚至終點消失。

（3）正常卡爾費休反應的最大速率在5.5到8的pH範圍之間，在實際操作過程中應避免pH值小於4和大於8；pH大於8.5時，由於碘和氫氧根或甲基化離子之間的反應，反應速率會增大，但這將導致終點消失，並消耗更多的碘（滴定劑）。

3、水分測定方法的開發與研究

樣品成分/處方分析

方法開發前一定要對樣品進行處方/成分分析：主要分析樣品中是否有與卡爾費休試劑發生副反應；反應不產生水、反應產生水。

與氫碘酸反應產生水的例子：

氫碘酸能與下述物質反應（無水）：鹼、氯、氧氣、高錳酸鉀、強氧化劑。

主方法選擇

（1）方法有：費休容量法、費休庫倫法、乾燥法、甲苯法。

（2）化學原料藥及製劑/化學輔料：通常首選費休容量法，水分檢測範圍1%-100%， 工作效率高檢測結構準確度高。

（3）中藥材：通常首選乾燥法（105℃乾燥5小時，恆重5mg），耗時工作效率低。4.含有揮發成分：首選甲苯法（只適合中藥材）。

（4）對於含微量水且對水分要求很高、且是無水合物產品，通常首選費休庫倫法，水分檢測範圍0.001%-0.1%。

（5）對於含有結合水/結晶水樣品，優先選用費休法（容量法與庫倫法）。

（6）根據樣品形態性質選用方法：固體樣品優選容量法，液體和氣體優選庫倫法。

KF滴定劑選擇

（1）滴定劑有單組分（含吡啶） 、雙組分、醛酮專用、陽極液

（2）庫倫法測定水分首選陽極液。

（3）分析樣品結構式，如果樣品含有醛酮結構，檢測水分首選醛酮專用滴定劑。

（4）一般常用水分檢測用，對於含水量低（0.1%≤水分≤0.5%）、且檢測準確度要求高， 首選單組分（含吡啶） 選用機率超過90%，其他一般可選用不含吡啶；其次選擇雙組分 （詳見對比表）。

KF方法溶劑選擇

（1）溶劑開發原則：

①樣品中含游離水，樣品不需要完全溶解； 樣品含有結合水/結構水，樣品需要溶解。

②溶劑不能影響樣品水分檢測，不能與樣品有任何反應。

③如果樣品不能溶解，可適當添加助溶劑，如甲醯胺、DMF

（2）溶劑有無水甲醇、無水乙醇、無水甲醇- 甲醯胺/DMF。

（3）溶劑首選無水甲醇。

（4）樣品含有醛酮結構，檢測水分首選無水乙醇作為溶劑。

（5）對於不容易溶解的樣品，可配置不同比例濃度的無水甲醇-甲醯胺首混合溶液，比例不要超過60：40（%，V/V），通過實驗對比總結（主要是反應終點快慢），經典比 例為無水甲醇-甲醯胺=70：35（%，V/V）。

（6）對於樣品pH偏高，會引起副反應發生，導致連續反應，而無終點出現或很難達到終點，此時應該加入少許苯甲酸或水楊酸，進行緩和中和一些高鹼性環境（不能用乙酸）。

KF方法儀器參數開發選擇

（1）轉速：經典值 200R/min

（2）水分標定：

起始漂移值（檢測前平衡）：20以下漂移值；

終點漂移值（結束） ：15-50 漂移值。

（3）樣品檢測：

起始漂移值（檢測前平衡）：30-50以下漂移值；

終點漂移值（結束）：25-60漂移值。

（4）對於樣品檢測很難達到終點，可將終點漂移值適當提高100。

樣品取樣量及樣品處理研究

（1）對於含水量小於 1.0%大於 0.5% ，樣品取樣量為 0.2-0.5g；

（2）對於含水量小於 0.5%大於 0. 1% ，樣品取樣量為 0.5-1.0g；

（3）對於含水量小於 0. 1% ，樣品取樣量為 1.0-2.0g；

（4）對於樣品經濟價值高，可根據含水量酌情規定取樣量30-50mg，且可根據實際測定情況選用庫倫法進行驗證或直接選用庫倫法（例子：高價值抗腫瘤藥）；

（5）對於無水合物樣品，可根據含水量酌情規定取樣量1.0g-1.5g,如果產品屬於高價 值產品，可選擇低取樣量庫倫法。

（6）由於樣品化學性質導致其 pH 值不同，呈酸鹼性，樣品處理方法：

①對於酸性樣品，樣品導致溶劑 pH 值太低或過酸，可選擇咪唑作為調節劑；

②對於鹼性樣品，樣品導致溶劑pH值太高或過鹼，可選擇苯甲酸或水楊酸作為調 節劑。

③在方法開發時就應該進行對樣品+溶劑的pH值進行研究開發，維持系統pH6.5。

（7）樣品取樣量：以消耗卡爾試劑2~3ml為標準（F值為3.758mg/ml）。

樣品溶解性研究與助溶劑篩選

（1）首先研究在甲醇中的溶解性（費休法溶劑90%以上都是首選無水甲醇系統）。

（2）其次研究在水中的溶解性，主要研究其pKa值（也就是pH值），為確定其滴定系統最優pH環境（pH5.5~7.5）；在實際開發中是否需要添加緩和劑。

（3）研究樣品在乙二醇、甲醯胺、DMF、DMSO、二氯甲烷等助溶劑中的溶解性。

（4）助溶劑使用量研究：以剛好溶解為好（能在1分鐘內溶解為標準）。

（5）樣品吸濕性研究，為樣品水分檢測流程優化作依據：將溶劑先進行測量水分，再用溶劑進行溶解，將溶液進行一次性注射器轉移儲存測水分（一次性可以有效避開固體樣品稱量過程中水分干擾）總水-溶劑水。

檢測分析方法驗證

（1）專屬性：選擇1固定結合水樣品進行水分檢測，分別選用（庫倫法、容量法）檢 查體系專屬。

（2）SST：使用純化水 20mg 進行測定 6 次，計算其 RSD%。

（3）儀器精密度：選擇二水合酒石酸鈉基準試劑（也可以進行儀器檢定）。

（4）精密度：選擇開發的樣品（含有固定水分），重複檢測6次，計算結果RSD%。

（5）準確度：選擇開發的樣品，分別依次加入不同水分含量（25%、50%、100%）， 平行測定3次，計算測定結果RSD%。

三、操作注意事項

1.配置要求：乾燥器、電子天平（十萬分之一）、水分測定儀、除濕機、空調 。

2.電子天平、水分測定儀、乾燥器要放在同一房間內，且電子天平最好放在水分測定儀的旁邊（優先左旁邊），乾燥器也隨樣品性質而定，主要優化環境中水分的干擾。

3.不管樣品是否有吸濕性，統一轉移轉存在乾燥器中。

4.樣品在稱量到倒入測量杯中，全程必須有稱量舟與水分保護罩一體。

5.儀器開機預熱，準備實驗用器具材：稱量舟、稱量勺、微量注射器（50ul）、一 次性注射器（2.5ml）、溶劑、滴定劑，並檢查系統各個管路接頭以及乾燥劑。

6.系統置換：

①滴定劑置換/更換並檢查系統管路是否有氣泡（氣密性）；

②滴定杯 泵入新鮮溶劑（或無水甲醇），將滴定杯進行除水分預滴定（將測量杯進樣口先蓋上蓋子，注入2/3體積無水甲醇，接著用手輕輕晃動測量杯，直至掛珠消失，準備吸水紙， 快速將進樣口打開蓋子，迅速用吸水紙擦乾蓋子與進樣口內壁的液滴，迅速蓋上進樣口蓋子，並將測量杯內的液體排盡，重新注入新鮮的無水甲醇）。

7.水分標定： 穿戴好一次性手套（必須），調出標定模式，進行預平衡，稱量 12-15mg純化水，平衡好快速注入水分（進行減量法），進行標定，標定過程中準備下一份水分， 循環平行3次。

8.樣品檢測：調出測量模式並進行預平衡，用稱量舟稱取規定量樣品，平衡好快速 倒入樣品（進行減量法），進行測量，記錄消耗體積（如果無吸濕性，可在快要結束前30秒開始準備下一個樣品）。

9.標定時，水分儘量全部轉移或注入滴定杯反應液中，切記注入過力，將液體濺到滴定杯壁上，也避免微量進樣針接觸滴定液，或進樣針接觸其他液體或粉末。

10.樣品檢測過程，儘量不要暴露長時間外面，倒入滴定杯中儘量不要粘在壁上，也就是避免損失和測不到。

11.測定樣品水分一定要先水分標定，且水分標定和樣品水分測定活動要連貫完成

12.對於易吸水樣品，2次平行測定，樣品均應在乾燥器內拿出進行檢測，對於不易 吸水的樣品可在稱量後用保護罩將樣品進樣器和樣品一起套住密封（杜絕外部環境水分入樣）。

13.液體樣品一定要用濾紙擦乾外面的液體，不可存在漏撒樣。

14.整個操作過程切勿裸手操作，一定要帶上手套進行。

15.查看溫濕度表，酌情開空調/除濕機→開機檢查/準備→除水操作→標定→檢測。

四、故障解決

反應往正方向進行且測定結果快（反應終點快，終點很快終結）、准（終點平衡快）， 必須保證系統生成的「氫碘酸」不與檢品中成分反應。

五、小結

方法開發重難點主要體現在：容量法與庫倫法選擇、溶劑篩選、樣品處理、相關計算以及分析方法驗收標準；儀器的熟練使用以及檢測數據異常分析（包括儀器故障排查與解決）對方法研究至關重要。

水分檢測操作關鍵在於對原理的理解與運用，細化並優化檢測流程；熟練掌握儀器 使用也是基本。水分檢測儀器設備要想運用起來得心應手，就必須要掌握基本理論和儀器設備構造，以及嫻熟的操作功底；熟練掌握上述基本功，對我們工作是事半功倍。

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