1鐵死亡的發現及特徵
鐵死亡是Stocicwell於2012年發現的一種新型細胞死亡方式。在鑑定對Ras突變細胞有致死作用的新分子的研究中，Erastin和RSL3分子以非凋亡方式選擇性殺傷細胞，並且伴隨著線粒體形態的異常[1]。傳統的調控細胞死亡的抑制劑無法阻斷此過程，但抗氧化劑(維生素E)和鐵螯合劑卻可以逆轉此過程[2]，這種以脂質過氧化為特徵的鐵依賴性非凋亡性細胞死亡即鐵死亡[3]。
與己經鑑定出的11種受調控的細胞死亡方式相比，鐵死亡在形態、生化學特徵、調控蛋白和功能機制方面都各不相同。譬如，凋亡的主要形態學特徵包括細胞質濃縮，染色質高度凝聚，核裂解為碎塊，凋亡小體形成，線粒體形態在凋亡早期可維持正常，隨著凋亡過程進展可能會出現線粒體腫脹、空泡變等一些非特異性的改變。生化學特徵主要有半胱天冬蛋白酶的激活、DNA降解等[4]。自噬的主要形態學特徵包括細胞膜特徵化結構消失，不發生染色質凝集，出現大量自噬空泡，自噬溶酶體形成，生化學特徵主要表現為LC3蛋白-I到LC3蛋白-II的轉化、底物降解等[5]。而鐵死亡的主要形態學特徵表現為細胞核正常，線粒體膜密度升高，線粒體嵴減少；生化學特徵主要包括鐵和活性氧超載、絲裂原活化蛋白激酶的激活、抑制胱氨酸/穀氨酸逆向轉運蛋白系統和減少半胱氨酸攝取、穀胱甘肽(GSH)耗竭、釋放花生四烯酸介質等[6]。
2鐵死亡分子機制
鐵死亡是鐵依賴性、以脂質活性氧異常增多為特徵的一種獨立細胞死亡類型。脂質過氧化物的升高和穀胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)的降低是其發生的兩大標誌，鐵死亡的發生涉及脂質代謝、活性氧的生成與清除、鐵離子代謝異常等等，因而其內在分子機制與脂質過氧化、活性氧、GPX4、鐵代謝等必然有著密不可分的關係(圖 1)。
圖1 細胞鐵死亡調控機制示意圖
註：ACSL4，長鏈醯基輔酶a合成酶家族成員4; ALOX-15，花生四烯酸-15脂氧合酶; CoQ10，輔酶Q10; Cysteine，半胱氨酸; Cystine，胱氨酸; Ferritin，鐵蛋白; Ferritinophage，鐵自噬; FSP1，鐵死亡調控蛋白1; Glutamate，穀氨酸; GSSG，氧化型穀胱甘肽; LIP，不穩定鐵池; LOX，脂氧合酶; LPCAT3，溶血磷脂醯膽鹼醯基轉移酶3; NADPH，還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸; NFE2L2，紅細胞衍生核因子2樣蛋白2; NRF2，核因子E2相關因子2; PUFA，多不飽和脂肪酸; SAT1，精胺N1-乙醯轉移酶1; SLC3A2，溶質載體家族3成員2; SLC7A11，溶質載體家族7成員11; Transferrin，轉鐵蛋白; TfR1，轉鐵蛋白受體1。
2.1 活性氧和脂質過氧化的驅動
活性氧在組織內穩態中發揮重要作用，調節細胞信號傳導、分化，促進細胞損傷和死亡，其水平受細胞抗氧化系統的嚴格調控。鐵死亡過程中，組織細胞處於氧化應激狀態，過量的活性氧產生，攻擊生物膜，影響其流動性及結構，通過脂質過氧化鏈反應，質膜的過氧化反應在膜磷脂之間傳遞下去，對細胞產生致死作用。但生物體內存在著眾多的抗氧化劑，一般的內源性抗氧化系統由酶促抗氧化劑(超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、GPX和重組抗氧化酶)和非酶抗氧化劑(維生素或其類似物、礦物質和代謝物)組成，過量的活性氧通過酶促(脂氧合酶催化)和非酶(鐵依賴)途徑誘導脂質過氧化，導致細胞死亡。
PUFA是脂質過氧化的首選底物，特別是花生四烯酸和腎上腺酸最容易發生過氧化[7-8]，導致脂質雙分子層被破壞，影響膜功能。細胞膜中PUFA的生物合成和重構需要長鏈醯基輔酶a合成酶家族成員4(ACSL4)和溶血磷脂醯膽鹼醯基轉移酶3 (LPCAT3)參與[9]。ACSL4在體內可以催化脂肪酸活化合成脂醯輔酶A，這是脂肪酸分解代謝第一步反應的關鍵酶，而且在脂質過氧化物抑制GPX4的過程中ACSL4是必不可少的。降低ACSL4和LPCAT3的表達可以減少脂質過氧化底物在細胞中的積累，從而抑制鐵死亡，因此，ACSL4和LPCAT3已被認為是介導鐵死亡的關鍵蛋白[7]。
2.2 GSH-GPX4
抗氧化劑通過對活性氧等的清除在預防細胞損傷或癌變方面發揮作用。GSH是哺乳動物體內最主要、含量最豐富的含巰基的低分子多肽，有氧化型(GSSG)和還原型(GSH) 兩種形式，它可以通過抑制脂質過氧化，清除自由基, 對細胞起到保護作用，是人類細胞內主要的抗氧化劑，也是GPX4的理想底物。半胱氨酸是細胞GSH生物合成中的限速因子，通常在半胱氨酸飢餓，GSH耗竭和抑制GPX4後誘導細胞鐵死亡。
GPX4是穀胱甘肽過氧化物酶家族中極其重要的成員。GPX不僅具有清除自由基和衍生物的作用，還減少脂質過氧化物的形成，增強機體抗氧化損傷的能力，從而抑制致癌物和活性氧誘導的腫瘤發生，尤其GPX4可通過抑制脂質過氧化和鐵死亡而發揮其重要作用。GPX4基因的缺失可以導致早期胚胎致死。為了確保膜的完整性和減少活性氧引起的損害，GPX4利用還原GSH作為輔助因子，將脂質過氧化氫(R-OOH)轉化為脂質醇(R-OH)，阻止了Fe2+依賴的毒性活性氧的形成和積累，保護細胞膜中的的多不飽和脂肪酸防止其脂質過氧化[10]。同時細胞內氧化應激狀態也可以誘導GPX4活性增高，這可能是與激活核轉錄因子NF-kB，調節錳-超氧化物歧化酶、血紅素加氧酶等抗氧化物質的基因表達相關[11]。GPX4也是鐵死亡的關鍵調節因子，增強GPX4活性以及誘導其表達的因素均會降低細胞對鐵死亡的敏感性，反之亦然。研究[12-14]表明，Erastin和RSL3可以分別通過間接和直接的方式抑制GPX4的活性來誘導鐵死亡。Xc-系統是異二聚體，由糖基化的重鏈SLC3A2和非糖基化的SLC7A11通過二硫鍵連接形成，其中SLC7A11是調控GPX4活性的關鍵蛋白，SLC7A11-GSH-GPX4是經典的鐵死亡通路。SLC7A11的表達和活性進一步受到NFE2L2的正向調節[15]，NFE2L2信號通路是抵抗鐵死亡的重要防禦機制，受到抑癌基因TP53、BRCA1關聯蛋白1和Beclin1的負向調控[13]。Xc-系統的抑制決定了GSH水平的下降和鐵死亡的開始。而且Xc-轉導途徑是半胱氨酸合成GSH和維持細胞內硫醇氧化還原電位的重要來源，因此系統Xc-可能是一個很好的抗癌靶點，這也為腫瘤的治療和降低耐藥風險提供了新的思路。此外，鐵死亡誘導劑(FIN)56對GPX4水平也有著顯著影響。RSL3可以直接抑制GPX4的活性，而FIN56可降低GPX4的豐度和輔酶Q10的衍生量。FIN56並非Xc-系統的抑制劑，不影響GSH水平，而是通過翻譯後降解導致GPX4蛋白的丟失[16]。
2.3 鐵代謝
正常的鐵對生物的生存至關重要，是許多關鍵過程中必需元素，主要參與氧運輸、DNA生物合成，以及參與形成各種酶，如LOX、黃嘌呤氧化酶、還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶、線粒體複合體Ⅰ和Ⅲ等[17]。細胞內鐵離子超載，Fe2+可以通過Fenton反應催化形成具有代謝毒性的活性氧和過氧化磷脂，導致細胞損傷或死亡，因此，細胞內鐵離子攝入與釋放、儲存和轉運都是影響細胞鐵死亡的重要因素[18]。在大鼠中敲減鐵離子代謝的關鍵調節因子——鐵反應元件結合蛋白2可以有效降低細胞對鐵死亡的敏感性[1]。自噬亦可以通過影響鐵離子代謝，進而調節細胞對鐵死亡誘導劑的敏感性。儲鐵蛋白介導的選擇性自噬，簡稱為鐵自噬，通過調控細胞內的鐵離子轉運來增強細胞對鐵死亡的敏感性。近期研究[19-20]報導了核因子E2相關因子2 (NRF2)、熱休克蛋白B1等基因可通過調節細胞的鐵離子代謝，影響細胞對鐵死亡誘導劑的敏感性。鐵螯合劑可以抑制Erastin誘導的鐵死亡，而補充外源性鐵則可以增強Erastin誘導的鐵死亡。因此，鐵離子代謝也是誘導細胞發生鐵死亡的重要潛在調控點。
此外，腫瘤細胞的生長往往表現較強的鐵依賴性，眾多腫瘤調控因子，如Ras、p53、Nrf2等均可以影響鐵代謝從而調節腫瘤細胞的死亡。Ras突變的鐵死亡細胞與耐鐵死亡細胞相比，TfR1表達增加，鐵蛋白輕鏈(FTL)和鐵蛋白重鏈1 (FTH1)表達降低[21]，提示鐵攝取增加和鐵儲存減少可能導致鐵死亡過程中的鐵過載。鐵依賴型鐵死亡的更多直接證據也包括來自鐵代謝主要轉錄因子IREB2的研究，通過RNAi抑制IREB2可顯著增加鐵代謝相關基因的表達(如F-box、FTH1和FTL)，因此，靶向鐵死亡治療腫瘤具有臨床可行性及重要意義。
2.4 鐵死亡其他相關機制及信號通路
2.4.1 P53
P53是與腫瘤關係密切的抑癌基因，也是一種轉錄因子，通過與靶基因的啟動子結合，繼而激活或抑制其mRNA的合成[7]。TP53在大約50%的人類癌症中存在雙等位突變或缺失，導致腫瘤進展失控。2012年Li等發現p53的翻譯後修飾對轉錄和抑癌作用有重大影響，被稱為p533KR的乙醯化缺陷突變體無法誘導凋亡和細胞周期阻滯，但缺乏乙醯化的p53突變體可促進鐵死亡[3, 13]。而且，p53是Xc-亞基SCL7A11的編碼基因，下調SLC7A11的表達，抑制Xc-系統，從而影響GPX4的活性[13]，導致脂質過氧化積累和鐵死亡。p53亦可以激活SAT1，調控ALOX-15，促進細胞脂質過氧化，活性氧堆積，最終誘導鐵死亡[22]，敲除SAT1可顯著逆轉p53介導的鐵死亡。其他一些代謝相關基因，如鐵氧還蛋白還原酶[23]和穀氨醯胺酶2[24]等，均是p53介導鐵死亡的直接靶點[10]，故而p53作為代謝相關基因的調節因子在鐵死亡中有著相當重要的地位。
2.4.2 P62-Keap1-Nrf2通路
Keap1-Nrf2系統作為氧化應激、細胞損傷的傳感器發揮著重要作用，調控抗氧化酶相關基因的表達[25]。Nrf2是調控氧化還原平衡重要轉錄因子，在非激活狀態下位於細胞質中與Keap1相互作用，並經由泛素-蛋白酶體通路迅速降解。當活性氧水平升高時，Keap1無法泛素化Nrf2，導致Nrf2在細胞核積累，進而誘導與抗氧化、代謝和解毒酶相關的核靶基因表達，這一過程受到自噬受體p62的嚴格控制，p62是一種多功能蛋白，直接抑制Keap1，同時促進Nrf2激活[26]。研究發現，當肝癌細胞暴露於Erastin或索拉非尼時，p62-keap1-Nrf2通路的激活可阻止Nrf2降解，促進p62核積累，從而抑制鐵死亡[20]。
2.4.3 FSP1-CoQ10-NAD(P)H通路
GPX4是抑制鐵死亡發生機制的核心，然而研究發現GPX4缺失的細胞仍然能在鐵死亡激活狀態下生存，在此基礎上發現了之前並未識別的鐵死亡調控蛋白(FSP1)，進一步的研究證明FSP1對鐵死亡的抑制是由NAD(P)H依賴輔酶Q10介導，FSP1保護細胞的作用正是通過催化CoQ10的持續再生，提高自由基捕獲能力來抑制鐵死亡的發生[27-28]，對GPX4缺失引起的鐵死亡具有保護作用。而且靶向FSP1與GPX4抑制劑具有顯著的協同作用，可在多種腫瘤中誘導鐵死亡。FSP1-CoQ10- NAD(P)H通路作為一個獨立的平行系統，可與GSH-GPX4協同阻遏磷脂過氧化和鐵死亡。
除此之外，三羧酸循環和電子傳遞鏈，以及Erastin的另一個直接靶點，線粒體電壓依賴性陰離子通道[29]都可影響鐵死亡。
3膽管癌
膽管癌是起源於肝內、門周或遠端(肝外)膽道系統的惡性腫瘤，不包括膽囊癌和Vater壺腹癌。2017年，美國癌症聯合會和國際抗癌聯盟聯合發布最新版癌症分期手冊，重新定義了門周段膽管癌(pCCA)、遠端膽管癌(dCCA)和肝內膽管癌(iCCA)分期系統，罕見的混合性肝細胞-膽管細胞癌被歸為iCCA。膽管癌在不同國家的發病率差異很大，多數國家發病率＜6例/10萬人，但在智利、韓國和泰國北部等一些國家和地區的發病率異常升高[30]。
膽管癌潛伏期較長，早期症狀不明顯，如肝外膽管細胞癌(eCCA)通常在腫瘤阻塞膽道引流系統時才出現症狀。多數患者初次就診時已經處於腫瘤進展期，甚至已發生轉移，手術切除和肝移植是3種亞型早期疾病的潛在治癒性治療選擇。然而，由於晚期腫瘤局部浸潤，或腹膜、遠處轉移，或膽道重建選擇受限等原因，只有不到1/3的患者在診斷時被歸類為可切除的腫瘤手術，並且術後出現局部復發及遠處轉移高達60%。iCCA切除後的5年生存率為22%~44%，pCCA為11%~41%，dCCA為27%~37%[30]。對於晚期或不能切除的膽管癌患者，吉西他濱聯合順鉑是目前常用的一線化療方案，但中位總生存期＜1年[31]。此外，用於CCA早期診斷、預後預測和治療評價的生物標誌物仍相當有限[32]，如CA19-9和CEA是目前研究相對充分的兩種標誌物，但其結果與良性疾病及其他惡性腫瘤存在明顯重疊，診斷價值有限，而且他們對早期膽管細胞癌的敏感性較低，因此有必要深入探究關鍵分子機制，尋找新的診治靶點。
研究報導膽管癌發病的誘因包括肝內膽管結石、原發性硬化性膽管炎、肝吸蟲病、病毒性肝炎以及先天性膽道畸形等多種危險因素，但其共同特徵是多數都會導致膽汁淤積，進而引起膽管的炎性病變，氧化應激失衡，直至癌症發生。此外，在膽管癌發生過程中鐵代謝異常也參與其中，伴隨著鐵依賴性氧化應激增強[32]，因此，膽管癌惡性進展過程中的氧化應激失衡與鐵代謝異常均提示新型的細胞死亡方式鐵死亡參與其中，進一步探討鐵死亡在膽管癌發生發展中的可能機制，對膽管癌的防治具有重要的指導意義。
3.1 膽管癌與氧化應激失衡
誘發膽管癌的危險因素眾多，但其共同特點即因膽管的慢性梗阻，導致膽汁淤積，進而引起膽管的慢性炎性。有動物模型研究[33]證實，慢性膽管阻塞可以引起膽管癌的發生與發展。此外，在炎症微環境中，活性氧/活性氮可損傷生物大分子(DNA、蛋白質和脂質)，導致其功能障礙，形成氧化應激失衡的惡性循環，誘發癌症。氧化應激的失衡及氧化還原信號通路的失調是癌症進展和對治療耐藥的共同特徵[34-35]。近來研究發現，鐵離子也參與氧化應激引起的生物大分子損傷過程，炎症誘導的氧化應激可以導致Fe3+結合和TfR氧化，促進鐵積累和釋放；此外，鐵調素的表達通過骨形態發生蛋白和蛋白酪氨酸激酶2/信號轉導子和轉錄激活子3信號通路調控[36]。在炎症或感染刺激後，IL-6激活，通過鐵調素依賴性途徑或其他途徑抑制鐵轉運蛋白活性[37]，從而導致細胞內鐵超載，增加宿主對感染的易感性或癌症發生。羰基化是氧化應激誘導的一種不可逆的蛋白質修飾。羰基化蛋白在膽管癌組織中表達顯著升高。炎症誘導的血清轉鐵蛋白、熱休克蛋白70和Α1抗胰蛋白酶的羰基化可能在膽管癌的癌變中起關鍵作用[38]。血清轉鐵蛋白羰基化，可導致鐵的積累和釋放，增強Fenton反應。此外，具有抗氧化性質的熱休克蛋白70和具有蛋白酶抑制能力的Α1抗胰蛋白酶的羰基化則導致他們功能障礙，降解GPX4，促進鐵死亡，從而導致膽管癌的進展和不良預後[38]。綜上，炎症反應及相關氧化應激失衡在膽管癌的發生發展中有著至關重要的作用。
3.2 膽管癌與鐵代謝
肝臟是鐵在體內儲存的主要部位，過量的的鐵參與Fenton反應，產生活性氧，進而促進多不飽和脂肪酸的過氧化反應，導致嚴重的氧化應激和細胞損傷。與非腫瘤細胞相比，腫瘤細胞(特別是腫瘤幹細胞)的生長具有明顯的鐵依賴性[7]。腫瘤細胞內鐵水平的調節可以概括為：鐵攝取增加，鐵儲存和輸出減少，從而鐵水平升高以維持腫瘤細胞生長的高鐵需求[37]。鐵穩態的破壞在腫瘤發生和治療抵抗中發揮重要作用。
LIP是Fenton反應的鐵離子源，Fenton反應產生過量活性氧，參與了膽管癌發生發展的全過程[38]。鐵調控蛋白的異常表達或修飾以及TfR-1也在膽管癌發生發展中具有關鍵作用。上調TfR-1導致鐵攝取增強，LIP增加，從而促進腫瘤進展；敲除TfR-1則降低細胞內LIP、抑制膽管癌細胞遷移能力和增殖能力，並且鐵超載與膽管癌患者的不良預後顯著相關[39]。Tran等[40]發現在104例膽管癌腫瘤組織中，鐵蛋白、鐵調素和運鐵蛋白的表達較相對於周圍非癌組織降低，但轉鐵蛋白受體表達上調，轉鐵蛋白受體功能障礙可以顯著抑制Erastin誘導的鐵死亡。此外，暴露於外源性過氧化氫可以激活鐵響應元件，通過結合mRNA來抑制翻譯或降解鐵蛋白，參與調控鐵代謝過程[41]。為探索膽管癌治療的新方向提供了依據。
3.3 其他相關分子及信號通路
異檸檬酸脫氫酶1/2(IDH1/2)，BRCA1關聯蛋白1，AT豐富結構域1A和多溴蛋白1是iCCA中最常見的突變基因。IDH1/2突變與膽管癌中p53水平升高、鐵代謝和DNA高甲基化顯著相關[42]，並且與IDH突變相關的表觀遺傳學變化可能介導了其致癌效應。此外，膽管癌的發生常繼發於細胞DNA的損傷，存在多種癌基因與抑癌基因的突變，＞21%的病例Kras癌基因與＞37%的病例p53抑癌基因出現異常表達，表現為侵襲性更強的基因顯型[43]。在膽管癌患者的膽汁與胰液中同樣可以發現Kras基因與p53基因的突變，而這兩種基因在鐵死亡中都發揮重要作用。Kras/ERK信號傳導途徑下游的ADP-核糖基化因子6蛋白可通過抑制RSL3誘導鐵死亡降低對吉西他濱的耐藥性[44]。近期研究表明，抑制Xc-系統可以通過誘導鐵死亡逆轉頭頸癌細胞對順鉑的耐藥[45]，因此，鐵死亡的異常調控亦參與了腫瘤細胞的耐藥抵抗。
4總結與展望
鐵死亡是近年來發現的一種新型細胞死亡形式。隨著研究的不斷深入，發現其內在調控機制涉及多種分子的表達及信號通路。腫瘤細胞中鐵代謝異常及氧化應激失衡為通過調控鐵死亡靶向治療腫瘤提供了理論依據。雖然鐵死亡在腫瘤的發生、發展及治療的具體機制尚未完全闡明，但食品藥品監督管理局已批准的索拉非尼、柳氮磺胺吡啶等在腫瘤治療中效果顯著[7]，而且鐵死亡在放療、免疫治療、分子靶向治療、納米醫學抗腫瘤等方面也有明顯作用。膽管癌中鐵死亡調控機制研究已有一定進展，但仍需要進一步從代謝途徑、表觀修飾等多個層面深入分析相關機制，推動診治能力的提升，從而干預疾病的發生發展。
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http://www.lcgdbzz.org/cn/article/doi/10.3969/j.issn.1001-5256.2022.04.043
引證本文
楊銘鈺, 楊震, 任萬華. 鐵死亡在膽管癌中的作用機制[J]. 臨床肝膽病雜誌, 2022, 38(4): 951-955.
本文編輯：朱晶
公眾號編輯：邢翔宇
臨床肝膽病雜誌 2022年第4期
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