β-丙氨酸是一種重要的平台化合物，已被廣泛應用於醫藥、飼料和食品添加劑等領域中。目前工業上主要通過化學法和酶法生產β-丙氨酸。微生物發酵法生產β-丙氨酸是一種有潛力的生產方法，但是由於發酵成本、效價和產量不高使其工業化生產仍面臨挑戰。
近日，來自浙江工業大學的柳志強課題組通過重規劃大腸桿菌中心碳代謝流、改造L-天冬氨酸-α-脫羧酶（aspartate-α-decarboxylase，ADC），並通過發酵條件優化將微生物發酵生產β-丙氨酸產量提升至85.18 g/L。糖磷酸轉移系統依賴磷酸烯醇式丙酮酸為磷酸供體攝取葡萄糖並生成丙酮酸，這使部分碳代謝流進入TCA循環的氧化分支，造成代謝流損失。因此，研究提出了一種新的β-丙氨酸的合成路線，引入丙酮酸羧化酶將代謝流重新引向β-丙氨酸合成途徑，通過該路線能獲得最高的理論產量，研究利用代謝工程手段對新路線進行了測試。首先，通過在E.coli W3110中引入枯草芽孢桿菌來源編碼L -天冬氨酸-α-脫羧酶的panD基因，構建了生產β-丙氨酸初始菌株。接著，通過過表達磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、刪除編碼催化PEP到丙酮酸酶的pykA基因增強磷酸烯醇式丙酮酸到重要前體草醯乙酸的代謝通量。同時，引入穀氨酸棒桿菌的丙酮酸羧化酶基因，減少代謝流流向TCA循環氧化分支造成的損失。增加前體草醯乙酸供應後，研究進一步增強aspA基因，並引入穀氨酸棒桿菌的aspB基因，從而加強延胡索酸和草醯乙酸轉化為L-天冬氨酸。為優化β-丙氨酸的轉運，研究敲除了cycA基因以減少β-丙氨酸轉運回胞內。對代謝流完成改造後，β-丙氨酸搖瓶產量提升至4.36 g/L。為解決由於底物誘導導致的ADC的機理性失活，研究通過理性改造構建了ADC K104S突變體，並使平均時空產率大大提升。最後，研究通過優化發酵策略，使用基於pH穩態的分批補料發酵，並在發酵過程中添加甜菜鹼調節滲透壓，同時控制溶氧在20%的水平，最終使β-丙氨酸發酵效價達85.18g/L，產率為0.24g/g葡萄糖，時空產率為1.05g/L/h。
綜上，該研究通過重規劃中心碳代謝流、改造天冬氨酸脫羧酶、發酵策略優化，最終使得β-丙氨酸發酵效價達85.18g/L，這是文獻報導的微生物發酵生產β-丙氨酸最高產量，為其工業應用奠定了堅實的基礎。
相關文章發表在《ACS synthetic biology》，題為 」Rerouting Fluxes of the Central Carbon Metabolism and Relieving Mechanism-Based Inactivation of L-Aspartate-α-decarboxylase for Fermentative Production of β-Alanine in Escherichia coli「，李波為文章第一作者。
（周曉傑 摘譯）