來源：小桔燈網
作者：動力彩虹
自2019年12月新型冠狀病毒SARS-CoV-2傳播以來，已經過去了兩年多，但感染的發生率並未減少。從公共衛生的角度來看，對感染者進行早期診斷和隔離可有效防止感染的傳播。快速、敏感和頻繁的檢測對於早期診斷很重要。對於SARS-CoV-2感染的診斷，逆轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）由於其高靈敏度（~ 2–20am,（1-10 copies/ul））已被用作「金標準」平台。此外，基於CRISPR的核酸檢測方法，如SHERLOCK和DETECTR，由於其高靈敏度（~ 2–20am,（1-10 copies/ul）），相對較短的分析時間（幾十分鐘），並與緊湊的檢測平台兼容亦引起關注。大多數基於CRISPR的方法涉及目標核酸的等溫擴增，以及使用Cas12a或Cas13a對擴增的核酸進行螢光或比色讀出。擴增步驟對於提高檢測靈敏度是必不可少的，但它會延長檢測時間（至少幾十分鐘）。
不久之前，研究團隊將基於CRISPR的核酸檢測和微反應室技術相結合，開發了一個稱為SATORI（基於CRISPR的無擴增數字RNA檢測）的無擴增RNA檢測平台。SATORI可在5min內檢測到單鏈RNA（ssRNA），如SARS-CoV-2 RNA，分析檢測限（LoD）約為5fm（3X103 copies/ul），能夠在大多數患者臨床標本中快速診斷SARS-CoV-2 RNA感染。然而，當用於高效篩查時，LoD應<10 2copies/ul。此外，SATORI還包含幾個手動處理步驟，這些步驟可能會導致人為錯誤並降低分析精度。
近日，為了解決這些問題，同一個研究團隊在雜誌Communications Biology 上發表了一篇題為「Automated amplification-free digital RNA detection platform for rapid and sensitive SARS-CoV-2 diagnosis」的文章，在文章中，研究團隊開發了SATORI的全自動版本，稱為SATORI自動化平台（opn-SATORI）。實驗結果證明，opn-SATORI可以在臨床標本中檢測SARS-CoV-2 RNA，其靈敏度與RT-qPCR相當，並且可以在約9min內區分SARS-CoV-2變體，準確率為98%。
圖片來源：Communications Biology
主要內容
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自動化平台的開發。
為了自動化SATORI檢測流程，研究團隊開發了一個RNA檢測平台，該平台由三個主要組件組成：compact disk（CD）設備、螢光顯微鏡和機器人（圖a）。基於CD的設備包含約10 8個圓柱形飛升級微反應室。與其他數字檢測方法不同，opn-SATORI的CD設備不需要微流控通道中複雜的溶液交換過程，可以以全自動方式完成從樣品混合到圖像分析（圖b）。開發的平台自動啟用以下檢測過程：（i）通過在試管中將含有預裝Cas13a crRNA複合物和螢光猝滅基團標記的ssRNA reporters（FQ reporter）的酶溶液與含有crRNA互補ssRNA靶標（tgRNA）的樣品溶液混合，製備反應溶液，（ii）將反應溶液滴入CD裝置上的小室，（iii）用一滴油密封小室，（iv）積累來自Cas13a介導的FQ reporter裂解（反式裂解），（v）使用螢光顯微鏡從約500000個微反應室獲取圖像，以及（vi）計數螢光（陽性）小室的數量，以量化樣本中的tgRNA拷貝數（圖c）。整個過程可以自動重複，並且可以使用單個反應分析48個樣本。
無擴增數字RNA檢測的自動化平台。
圖片來源：Communications Biology
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Cas13a的篩選。
為了提高檢測靈敏度，研究團隊篩選了Cas13a同源序列並優化了緩衝條件。LwaCas13a和LbuCas13a因其強大的反式切割活性而被用於基於CRISPR的核酸檢測。此外，LtrCas13a與LwaCas13a和LbuCas13a高度同源，並與LwaCas13a具有類似的抑制細菌生長的作用。結果表明，使用LtrCas13a及Ltr緩衝液時，陽性小室數量最多，且隨著tgRNA濃度（300aM–300fM）增高，Ltr緩衝液中陽性小室的數量呈線性增加。在試驗開始後約7分鐘（油封后3分鐘），LtrCas13a檢測到SARS-CoV-2的N基因RNA和全基因組RNA，LoD值分別為220和280 aM（1.3×102和1.7×102copies/ul）。鑑於所獲得的快速、靈敏和穩健的反式切割活性，LTRCA13A和Ltr緩衝液的組合最適合用於此RNA檢測平台。
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提高病毒RNA檢測靈敏度。
由於平台檢測總體積約為15 nL（500000×~30fL）的微室陣列中隨機捕獲的tgRNA分子，超過99%的tgRNA分子在油封過程中被丟棄，從而導致靈敏度降低。為了克服這一缺點並進一步提高靈敏度，研究團隊使用生物素-鏈霉親和素磁珠技術在微腔內富集tgRNA分子。將包被鏈霉親和素的磁珠添加到含有生物素標記的LtrCas13a crRNA複合物、tgRNAs和FQ reporter的反應溶液中，以捕獲磁珠上的LtrCas13a-crRNA -tgRNA複合物，隨後將混合物滴到CD設備上，通過磁力將複合物濃縮到腔室中，並用油密封腔室（圖a）。該程序在5min內自動完成，與未經磁珠處理的程序相比，陽性小室的數量增加了約50倍（圖b），表明LtrCas13a-crRNA-tgRNA複合物在微室中成功富集。在試驗開始後約9分鐘（油封后3分鐘），平台檢測到SARS-CoV-2的N基因RNA和全基因組RNA，LoD值分別為2.4和6.5aM（1.4和3.9 copies/ul）（圖d）。
Opn-SATORI平台。
圖片來源：Communications Biology
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SARS-CoV-2變異毒株的鑑別。
研究團隊試圖使用opn-SATORI來區分SARS-CoV-2變體。針對相應的變異毒株，即B.1.1.7（α）、B.1.351（β）和B.1.617（δ）中的N501Y、E484K和L452Rspike突變，各設計了20個crRNA，並進行比較篩選。結果顯示，在試驗開始後約9分鐘內（油封后3分鐘），WT SARS-CoV-2與每個變體之間的比率存在顯著差異，從而能夠快速準確地識別SARS-CoV-2變體。不僅如此，B.1.1.529（ο）變體也可以準確區分。總之，這些結果表明，使用opn SATORI和針對特定突變的適當crRNA對可以檢測新出現的SARS-CoV-2變體。
SARS-CoV-2變異株的鑑別。
圖片來源：Communications Biology
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臨床驗證。
研究團隊驗證了opn-SATORI是否可用於診斷SARS-CoV-2感染。使用靶向N基因RNA的crRNA，研究團隊評估了來自Ct值為15–30（10 WT、10 alpha、10 Japan、10 delta和10 omicron變體）患者的50份人類鼻咽拭子衍生RNA樣本和來自健康人的10份RNA樣本。樣品的陽性室數與RT-qPCR測定的拷貝數（Ct值）相關性良好，相關係數為0.60（圖c）。此外，Bland–Altman分析表明，opn-SATORI和RT-qPCR獲得的結果具有良好的一致性。opn-SATORI區分了SARS-CoV-2陽性和陰性樣本，準確率為98%，陽性準確率為100%。
此外，研究團隊通過檢測N501Y、E484K、L452R和Q493R/G496S/Q498R spike突變來進行變體鑑別，這些突變已通過全基因組測序（WGS）確認。結果表明，在上述臨床樣本中檢測到N501Y、E484K、L452R和Q493R/G496S/Q498R突變，分別與WGS結果100%、100%、90%和100%一致，從而能夠以98%的準確率鑑別SARS-CoV-2變異毒株。這些結果證明了opn-SATORI在快速準確診斷SARS-CoV-2感染方面的潛力。
臨床驗證。圖片來源：Communications Biology
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總結和討論
在這裡，研究團隊證明了opn-SATORI是一個敏感、快速和自動化的ssRNA檢測平台，可以精確診斷SARS-CoV-2及其變體。研究團隊將生物素-鏈霉親和素磁珠技術集成到平台中，大大提高了opn-SATORI的檢測靈敏度。獲得的靈敏度（LoD為2.4aM（1.4 copies/ul）比抗原檢測高1000倍以上（～17 fM（1.0×10 4copies/ul），並與RT-qPCR（約2-20 aM（約1-10 copies/ul））相當。Opn-SATORI檢測SARS-CoV-2 RNA無需擴增，在約9分鐘內就能完成檢測（從樣本混合到圖像分析的時間），而RT-qPCR和其他基於CRISPR的方法至少需要幾十分鐘的檢測時間。SATORI基本上不受人類拭子污染物的影響，這表明opn-SATORI可以通過無核酸提取程序而更快、更簡單地發揮作用。使用opn-SATORI和適當的crRNA對可以識別單個基因突變，並以高特異性（98%）區分SARS-CoV-2變體。在幾天內，研究團隊就完成了從針對B.1.1.529（ο）變異體中spike突變的crRNAs設計到成功識別變異體的所有過程，突出了opn-SATORI在有效篩查新出現的SARS-CoV-2變異體方面的效用。
Opn-SATORI的使用可以在社會上實施，並廣泛應用於城鎮診所、機場檢疫站和其他地方。Opn-SATORI（傳統的基於CD的器件）的器件製造成本約為0.01美元/次，檢測試劑的成本約為每項檢測2美元，與RT-qPCR和抗原檢測的成本相當（每項檢測1.21-4.39美元）。
由於opn-SATORI平台使用機器人和螢光顯微鏡，並且相對較大，因此開發一個更緊湊的通用平台非常重要。鑑於基於CRISPR-Cas13a的方法已用於癌症診斷中的miRNA檢測，opn SATORI可作為多種應用的多功能平台，包括診斷病毒感染和評估液體活檢的疾病相關生物標記物。