1. 基因敲除小鼠
1）構建具有干擾基因的幹細胞
首先克隆一段含有待敲除的小鼠基因的DNA，然後用新黴素抗性基因插入其中，斷開這一靶基因，在克隆基因的其他部位（靶基因之外）引入一個胸苷激酶基因，這兩個額外基因將用於後面剔除未發生定向敲除的克隆子。
接下來將構建小鼠的DNA與褐色小鼠的胚胎幹細胞混合，這些幹細胞可以分化成任何類型的小鼠細胞，在其中一小部分細胞中，被斷開的基因通過某種途徑進入細胞核，並於細胞中同源的野生型靶基因之間發生同源重組，從而使斷開的靶基因能夠進入小鼠基因組中，並移去胸苷激酶基因，最後通過新黴素衍生物G418殺死無新黴素抗性的細胞，即未發生同源重組的細胞，除了同源重組外，還可能出現非同源重組產生帶有隨機插入的斷開靶基因與胸苷激酶基因的細胞，此時通過丙氧鳥苷可以殺死殺死含有胸苷激酶基因的細胞，最後只留下發生同源重組的細胞。
2）第二階段，將斷開基因置入動物體內
將含有斷開基因的細胞注入到黑鼠的囊胚期胚泡中，將這個混合胚胎植入代孕母鼠的子宮內，隨後代孕母鼠產下嵌合體小鼠，依據其黑色和棕色皮毛可以鑑定，待嵌合體小鼠（雄鼠）成熟，將其與野生型雌性黑鼠交配，丟棄來源於野生型胚胎的黑色後代後，只有棕色小鼠來自轉基因移植的細胞，隨後選擇一對含有斷開基因的雌雄棕色小鼠讓它們交配，再用southern印記檢測棕色後代的DNA，這一次找到斷開基因的純合體，即為轉基因小鼠，接下來通過觀察轉基因小鼠表型以確定敲除後的影響。
2. 轉基因小鼠
一般採用兩種方法，第一種，直接將克隆的外源基因注射到精子的細胞核中，此時精細胞和卵細胞剛受精，精卵細胞的核尚未融合，由此允許外援DNA自行插入到胚胎細胞的DNA中，通常以成串的重複基因形式插入，這種插入是在胚胎發育的很早期發生的，但是即使只有一兩個胚胎細胞發生了分裂，在產生的成年個體中就會有一些細胞不含轉入基因，這一個體就是嵌合體，因此，接下來的步驟就是將這些嵌合體與野生型小鼠雜交，挑選帶有轉基因的鼠仔。
帶有轉入基因說明它們是從帶有轉入基因的精子或卵細胞分化而來的，因此它們體內的每一個細胞都會含有轉入基因，這些就是真正的轉基因小鼠了。
另一種辦法是將外源DNA注射到胚胎幹細胞中，產生轉基因ES細胞，這些ES細胞可以像正常胚胎細胞一樣發育，因此，如果轉基因ES與早期正常小鼠胚胎混合，它們就開始分化，並伴有正常胚胎細胞，結果產生嵌合體，其中一些細胞含有轉基因，另一些則沒有，隨後將嵌合體與野生型小鼠雜交，得到真正的轉基因鼠仔。
Ref:《分子生物學》Robert F · Weaver著