2022年9月28日，發表在《Nature》上的一項最新研究中，來自哈佛醫學院董民教授等人領導的研究團隊在昆蟲細胞上首次利用CRISPR/Cas9篩選技術，找到了一種特異性針對昆蟲的細菌蛋白毒素（Tc toxin）的受體。這一工作在分子水平上揭示了毒素的作用機理和對不同昆蟲的特異性，不僅建立了對這類毒素在自然界的功能的深刻理解，而且有助於將來進一步發展高效特異的生物殺蟲劑，用來控制農業害蟲和其他傳播疾病的昆蟲。
細菌蛋白毒素是很多致病菌的主要武器，例如白喉毒素，炭疽毒素，肉毒桿菌毒素等等。近年來，全基因組CRISPR/Cas9篩選技術在哺乳動物細胞上得到廣泛應用，成為研究這些針對人和動物的毒素和病原菌的主要實驗方法。昆蟲是地球上種類最繁多的動物，在整個生態鏈上起到至關重要的作用。在自然界中，存在許多專門靶向昆蟲的細菌蛋白毒素， 有些已經被廣泛地應用於農業害蟲防治 。現有的CRISPR/Cas9篩選技術依賴針對哺乳動物細胞的慢病毒轉染系統，不適用在昆蟲細胞上，大大限制了人們對針對昆蟲的蛋白毒素作用機制，抗性，宿主特異性以及開發新型殺蟲毒素等問題的研究。這項工作建立了在昆蟲細胞上開展非病毒的全基因組CRISPR/Cas9篩選毒素受體的方法，為應用全基因組篩選這一關鍵技術來研究多種多樣的針對昆蟲的毒素，病原菌，病毒，眾多蟲媒病原菌和病毒，以及昆蟲細胞生物學問題提供了開創性的榜樣。
作者主要研究的是一種來源於昆蟲病原線蟲腸道共生菌的細菌毒素Tc toxin。 這種毒素有著非同尋常的生態角色：這類細菌寄生在土壤中的特定線蟲體內，這些線蟲專門尋找併入侵到土壤中的昆蟲幼蟲體內，然後釋放出這些細菌到昆蟲體腔內，這些細菌再用分泌的毒素來抑制昆蟲的免疫反應，然後細菌大量繁殖，線蟲再以細菌為食物，繁殖下一代，最終殺死昆蟲。1998年 R H ffrench-Constant組首次報導從昆蟲病原線蟲共生菌，發光光杆狀菌 (Photorhabdus luminescens) 中分離到活性蛋白毒素（Tc Toxin）。為了更好的利用開發昆蟲病原線蟲這一重要的生物防治資源，人們一直對Tc 毒素相關的分子機制的研究很感興趣，並陸續在不同菌屬細菌里發現了上千個Tc毒素家族成員，但卻對其昆蟲宿主因子知之甚少 。
董民實驗室發現Tc toxin 家族的代表 毒素（pTc） 對多種人源細胞系毒性較低，而對果蠅S2R+細胞毒性較高，5 pM的毒素可以讓50%的果蠅細胞呈現毒理表型， 這暗示了果蠅S2R+細胞表面很可能存在對 Tc 毒素高特異的受體。與此同時，哈佛醫學院Norbert Perrimon教授實驗室於2018年開發了應用於果蠅S2R+細胞全基因CRISPR/Cas9 篩選的文庫，利用整合酶介導的gRNA基因組定點整合的方法，不需要使用慢病毒轉染。作者發現pTc 毒素可以通過修飾細胞內肌動蛋白抑制S2R+細胞分裂，但中毒S2R+細胞基因組依然可以保持複製，進而導致中毒S2R+細胞體積隨著時間不斷增大。 正是利用這一特徵，在實際篩選中，作者巧妙地利用30微米孔徑的細胞篩分離中毒細胞以及對毒素有耐性的細胞。 通過幾輪的富集和高通量測序， 最終鑑別出了一個單次跨膜的Mucin家族蛋白，Visgun，作為pTc毒素特異性受體。
圖1：Tc毒素全基因組篩選
接著研究者進一步揭示了雙翅目的埃及伊蚊，瘧蚊以及鞘翅目的赤擬谷盜Visgun同源蛋白均可高效識別pTc毒素，而來源於鱗翅目的草地貪夜蛾和大臘螟Visgun同源蛋白則不能作為受體. 通過比對它們的蛋白序列，提示具有高度富集O-glycan修飾位點是不同昆蟲物種Visgun同源蛋白能否作為pTc毒素受體的必要條件， 有意思的是，人的同源蛋白CD164正好缺乏這一特徵，這些發現在分子水平上解釋了Tc毒素對宿主的選擇特異性。
最後作者以果蠅作為昆蟲宿主模型，發現Visgun蛋白主要在血細胞表達，而這些細胞正是昆蟲的主要免疫系統。敲除Visgun蛋白可以降低原代血細胞對pTc 毒素的敏感性，並且 在被pTc毒素預處理後，這些血細胞依然保持吞噬細菌的能力。在被感染髮光光杆狀菌後, Visgun蛋白敲除的果蠅也表現出較低的致死率和病原菌載量，這揭示出在病原菌感染的初期，低劑量的Tc毒素被分泌到昆蟲體腔後，可以通過高特異性的Visgun受體進入昆蟲血細胞，通過破壞昆蟲免疫系統防線，為病原細菌的進一步整殖和最終殺死宿主創造條件。
圖2：敲除Visgun蛋白降低果蠅血細胞對Tc毒素的敏感度
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https://doi.org/10.1038/s41586-022-05250-7