核酸和蛋白質是組成生命的主要生物大分子。在生物體內，蛋白質與蛋白質、蛋白質與 DNA、蛋白質與 RNA 之間存在密切的相互作用，這些相互作用是生物體生長、繁殖、運動、遺傳和代謝等生命活動的基礎。

如果某個分子或某些分子動力學特徵（形狀、結構和運動狀態）發生改變，可能會對人體健康產生影響。因此，研究蛋白質/核酸互作等重要生物分子事件，對於解析病毒生物學和腫瘤生物學等關鍵科學問題具有重要意義。

傳統生化方法無法直觀、真實展現蛋白質/核酸互作等重要生物分子事件。通過生物學、化學等不同學科交叉，開發活細胞/活體生物分子互作傳感技術，解析潛在的關鍵分子機理，已成為推動細胞生物學等領域研究的有力工具。

近日，絡繹科學邀請到了中國科學院深圳先進技術研究院（以下簡稱為「深圳先進院」）合成生物學研究所副研究員、碩士生導師陳明海圍繞「基於片段互補的生物分子傳感系統開發及應用」這一主題進行分享，報告了基於螢光蛋白以及螢光素酶等分子探針開發的合成生物傳感系統。

▲圖丨陳明海（來源：陳明海提供）

陳明海於 2017 年獲得中科院武漢病毒研究所微生物學專業博士學位，隨後前往維吉尼亞大學生物化學專業開展博士後研究工作。2019 年 7 月，他加入中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所，任副研究員職位，主要研究方向是基於合成生物學技術發展新型螢光傳感系統用於生物體內關鍵分子事件的檢測及相關機理的研究。相關研究成果以第一作者或共同通訊作者發表於 ACS Nano, Biomaterials, Chem. Sci., Anal. Chem.等專業期刊。

開發基於片段互補技術的生物分子傳感系統

生物體的許多生命過程，如細胞的信號傳導、細胞骨架的形成以及細胞的代謝，均受到蛋白質之間相互作用的調控。目前研究蛋白質相互作用的方法主要有：基於抗原抗體相互作用的免疫共沉澱、表面等離子體共振技術、用於大規模篩選的酵母雙雜交系統，以及基於供體與受體之間的螢光共振能量轉移技術。

陳明海團隊基於片段互補技術開發了系列、多尺度可視化研究蛋白質/核酸互作等合成生物分子傳感系統。

「目前有很多的功能蛋白被拆分作為片段互補系統來檢測蛋白質之間的互作。如果選用的功能蛋白是螢光蛋白，所構建的互補系統就叫做雙分子螢光互補系統（Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC）。」他介紹說。

（來源：陳明海提供）

它的基本原理就是以螢光蛋白作為材料，根據其序列和結構，在合適的拆分位點將其拆分成兩個沒有功能的螢光蛋白片段，然後將這兩個蛋白片段分別通過 Linker 與待研究的兩個蛋白相互融合。如果兩個目的蛋白彼此間存在相互作用，或者是在配體的作用下可以形成蛋白相互作用複合體。這樣就可以使拆分的兩個功能蛋白的片段彼此融合，產生完整的一個功能蛋白，從而發揮功能即產生螢光。

陳明海介紹道，目前螢光蛋白大致分為兩類。

一類是大家所熟悉的綠色螢光蛋白(Green fluorescent protein，簡稱GFP)，其晶體結構顯示，蛋白質是一個圓柱形水桶樣結構，由 11 個圍繞中心 α 螺旋的反向平行 β 摺疊組成，發色團位於桶狀結構內部的一個 α 螺旋上，主要通過胺基酸的氧化和環化來產生螢光。

另一類是近十年剛報導的來源於細菌的光敏色素蛋白。目前這種光敏色素被廣泛用於不同的細胞組織以及活體成像。該類蛋白具備如下特點，第一是具有比較大的激發峰和發射峰，均在接近 700nm 的近紅外區域，很多都是在光學窗口的範圍內；第二是它的結構與大家所熟知的 GFP 的桶狀結構有很大的不同，通常包含兩個結構域，或者是單個結構域，而不是這種明顯的桶狀結構；第三也是最重要的一點是它的發色團是膽綠素，膽綠素是正常的細胞代謝過程中所產生的一種小分子物質，內源性的低濃度的膽綠素就可以使它產生很強的螢光。

兩個蛋白質互作的檢測及系統技術優化

「為了開發基於光敏色素蛋白的雙分子螢光互補系統，團隊選擇了一種近紅外的光敏色素螢光蛋白——iRFP，它的最大激發峰是在 690nm，最大發射峰是在 713nm，已經被證實可以很好地在動物活體上進行螢光標記。」陳明海說道。

具體來說，首先根據該螢光蛋白的空間結構，在它的 loop 環內共選取了多個拆分位點，發現有四個位點可成功構建雙分子螢光互補系統，之後在動物活體上驗證了檢測蛋白質互作的可行性。

「團隊還將這個互補系統應用於研究 HIV-1 的整合酶與宿主細胞的因子 p75 之間的相互作用，發現 p75 蛋白在靶標 HIV-1 的基因組整合到宿主細胞染色體的過程中起到了很關鍵的作用。並且基於這個系統篩選和評價了一些抑制劑，為 HIV-1 生命周期的理解以及防治提供了相應的研究基礎。」

不過，近紅外的光敏色素螢光蛋白的波長比較長，光量子產率較低，導致它的相對的螢光強度要顯著的低於大家熟知的 GFP 類型的螢光蛋白。這對於研究蛋白質之間的弱相互作用可能就會有一定的限制。

「所以，團隊嘗試通過串聯構建的策略來提高它的互補螢光強度。」

具體來說，將多個拆分的 N 末端片段與多個拆分的 C 末端片段分別與待研究的兩個蛋白相互融合。如果這兩個蛋白彼此間存在相互作用，就會使拆分的多個 N 末端片段與多個拆分的 C 末端片段重構，這樣理論上是可以產生更強的互補螢光。

最後，團隊也在活細胞及活體上證實了，通過串聯構建的策略產生的互補系統的螢光強度是目前在近紅外區域的互補系統中是最強的。

接下來，團隊又考慮到，由於拆分的螢光蛋白片段是分別作為 tag 與靶標蛋白相互融合表達的，如果這兩個螢光蛋白片段太大，理論上可能會對待研究的兩個蛋白之間的相互作用產生影響。

為了降低這種影響，陳明海團隊以 2019 年新開發的一個螢光蛋白作為材料，成功開發了近紅外的 BiFC 系統。這個螢光蛋白的最大發射峰是在 670nm，它是目前蛋白分子量最小的螢光蛋白，僅由 144 個胺基酸組成。

「經測定，與目前報導的這種近紅外的螢光互補系統相比，該系統的成熟速度和光穩定性都要更加優越。」

基於這一系統，團隊首次在活細胞水平上鑑定了新冠病毒的N結構蛋白與細胞應激顆粒蛋白（如 G3BP1、G3BP2）之間的相互作用。結合生化實驗進一步發現，N 蛋白的表達可以降低細胞應激顆粒蛋白 G3BP1 的表達水平，這些可能在新冠病毒入侵細胞過程中起到了一定的作用。

三個蛋白質互作的檢測及超高分辨成像

在生物體內，不僅有兩個蛋白質之間的互作，很多時候涉及到多個蛋白質之間的互作。能否在雙分子螢光互補系統的基礎上進一步延伸，開發一個檢測三個蛋白質之間互作的系統呢？

同時在普通光學成像的過程中，由於受到光的衍射極限的限制。目前的共聚焦所能達到的解析度大概是在橫軸 250nm 和縱軸 550nm 的範圍內。而很多蛋白質之間的互作通常是發生在十幾納米的空間內。

如果可以在超高分辨的水平或者是單分子的水平上來檢測這些蛋白質之間的互作，對於理解這些互作所發揮的功能將有很大的幫助。

目前超高分辨成像技術主要是基於兩類原理，第一類是通過改造光源的點擴散函數來實現超高分辨成像。另外一種是基於單分子成像的超分辨成像技術。

「團隊選取了螢光蛋白 mIrisFP，其一方面具有光轉換的特性；另一方面它還具有光轉化的特性。光轉換特性為做單子成像提供了一個前提。」

將螢光蛋白 mIrisFP 拆分成三個片段，然後分別與待研究的三個蛋白相互融合。原理同上。這個系統被命名為三片段螢光互補系統(TFFC)。

（來源：陳明海提供）

根據它的結構以及序列比對，團隊成功構建了 TFFC 系統，通過測定，發現拆分重構後的系統同樣具有這種光轉換的特性。而且團隊也在單分子水平上做了三個蛋白質之間的超高分辨成像，揭示了 G 蛋白不同亞基在單分子水平上是有不同的互作形式。

在此基礎上，能否將系統適當改造用於研究蛋白質與 RNA 之間的互作呢？

團隊的想法是，通過 MCP 與 ms2 的特異性相互作用，將螢光蛋白拆分的一個片段首先錨定下來，然後將另一個片段與待研究的目的蛋白相互融合。檢測原理同上。

團隊首先找到一些模式的蛋白和 RNA 的互作，證實了這樣一個系統是可以成功構建的。

（來源：陳明海提供）

基於這個系統，團隊在腫瘤細胞中鑑定了細胞骨架蛋白 FSCN1 與長鏈非編碼 RNAHOTAIR 之間的互作，以及它們互作的區域。由於長鏈非編碼 RNA HOTAIR 在腫瘤的生長發育以及遷移過程中起到一定的作用，因此 FSCN1-HOTAIR 互作的鑑定對於腫瘤功能研究可能有一定的幫助。

總的來說，基於 mIrisFP 的三片段的螢光互補系統既有優點也有缺點。優點是它具有光轉換的特性，可以在單分子水平上來檢測多個蛋白的互作。缺點則是該互補系統需要在低溫條件下，也就是 27℃ 條件下才能夠成熟，產生互補的螢光。這樣一來，對於在生理條件下多個蛋白質互作的檢測可能會有一定的限制。

因此，團隊想要開發一個在生理條件下成熟，且又能應用於三個蛋白質互作研究的三片段的螢光互補系統。

團隊以一個具有高螢光亮度的螢光蛋白 Venus 作為材料，成功地構建了在生理條件下成熟的三片段的互補系統。並且基於該互補系統，首次在活細胞水平鑑定得到，HIV-1 的整合酶與宿主細胞因子 BAF 和 p75 之間可以形成一個穩定的三蛋白複合物。該發現有助於理解 HIV-1 基因組整合的相關機理。

前面講的雙分子螢光互補系統通常是將一個螢光蛋白拆分成兩個片段，然後分別與待研究的兩個蛋白相互融合。如果團隊將螢光蛋白拆分成兩個片段之後，再通過 linker 連接，就可以構建成一個 cp 的螢光蛋白。這樣的 cp 螢光蛋白同樣也具有螢光，有時候可能會比較弱。但是這樣的結構很容易受到周圍環境以及結合的影響，因此為構建傳感器提供了很好的材料。

基於此，團隊開發了一個特異性檢測鋅離子的傳感器。該檢測可以在一定程度上評價胰島細胞分泌胰島素的功能水平。這一成果可能為 Ⅰ 型糖尿病的治療提供一定的參考。

基於螢光素酶的分子傳感器的開發及應用

此外，陳明海還介紹了團隊基於螢光素酶的分子傳感的開發及應用。

螢光素酶系統的特點是，其基於酶與底物催化之間的反應產生螢光，因此具有比較高的特異性，組織穿透能力比較強，適用於活體成像。

團隊選用了一個具有近紅外光譜性能的螢光素酶系統。原理同上，成功構建了基於拆分螢光素酶的互補系統。並在動物活體上驗證，該系統可以很好地成像蛋白質之間的相互作用。

與目前廣泛使用的紅色的螢光素酶互補系統 Fluc-SLCA 相比，該系統不論是在活細胞水平還是在活體水平，均展現出比較好的成像蛋白質互作的性能。

將該系統應用於研究新冠病毒的 N 結構蛋白與細胞的一些 RNA 處理過程蛋白之間的互作以及抑制劑篩選中，最終篩選到 Sapanisertib 能夠抑制細胞蛋白 RPL36 與新冠 N 蛋白之間的相互作用。這些發現可能為新冠病毒的防治提供相應的候選藥物。