亨廷頓病（Huntington's disease，HD），又稱亨廷頓舞蹈症，為四大神經退行性疾病之一，是一種常染色體顯性遺傳的神經退行性疾病。全球範圍亨廷頓病的發病率約為每 10 萬人有 2.7 例，歐美國家的發病率相對較高，每 10 萬人發病人數達 5.7 例。統計數據顯示，全球範圍已有超 20 萬人患有亨廷頓病，在美國患者數量已經超過 3 萬人。
儘管亨廷頓病的病因明確並且其遺傳機制早在二十多年前就已被發現，但目前還沒有獲批的療法能夠減緩病情發展或治癒該疾病。
近日，加利福尼亞大學聖地亞哥醫學院的研究小組開發出靶向 RNA 的 CRISPR-Cas13d 基因編輯技術，並被用於消除編碼導致亨廷頓病有毒蛋白質的 RNA 轉錄本，他們還在小鼠模型中證明其能夠有效減輕亨廷頓病的症狀。
目前，這項研究已經以「An RNA-targeting CRISPR–Cas13d system alleviates disease-related phenotypes in Huntington’s disease models」（靶向 RNA 的 CRISPR–Cas13d 系統可減輕亨廷頓病模型中與疾病相關的表型）為題發表在 Nature Neuroscience 上。
（來源：Nature Neuroscience）
「人體的細胞很難複製重複的 DNA，這些複製錯誤會導致重複序列隨著每一代的增長而變長，而具體到亨廷頓病患者的基因中，這些重複序列有時會長到正常長度的數倍，由此產生重複擴增的蛋白質會聚集在大腦中並形成有毒團塊，引起神經元壞死並導致亨廷頓病。」該論文的通訊作者、加州大學聖地亞哥分校醫學院細胞與分子醫學系教授 Gene Yeo 博士表示。
▲圖｜加州大學聖地亞哥分校醫學院細胞與分子醫學系教授 Gene Yeo 博士（來源：UC San Diego）
Gene Yeo 擁有伊利諾伊大學香檳分校獲得化學工程學士和經濟學學士學位、加州大學聖地亞哥分校拉迪管理學院工商管理碩士學位，以及麻省理工學院計算神經科學博士學位。目前，他是加州大學聖地亞哥分校細胞與分子醫學系教授以及 UCSD 幹細胞計劃和摩爾斯癌症中心研究員。Gene Yeo 實驗室現階段的研究方向主要圍繞 RNA 以及 RNA 結合蛋白（RBP），專注於揭示 RBP 影響基因表達的分子原理，RBP 介導的轉錄後基因網絡如何促進幹細胞和大腦的細胞穩態，以及 RBP 突變如何導致人類發育和神經退行性疾病。
截至目前，Gene Yeo 已經在 Cell、Neuron、Nature Methods、Nature Biomedical Engineering 等期刊發表論文 200 余篇，他曾獲得新加坡國家研究基金會訪問研究員獎、國際 RNA 學會職業獎等。值得一提的是，Gene Yeo 還是 Locana、Enzerna、Eclipse Bioinnovations 等生物技術公司的聯合創始人。
開發靶向 RNA 的 CRISPR-Cas13d 系統，動物試驗結果積極
亨廷頓病最早是由美國醫學家喬治·亨廷頓於 1872 年發現，該病因此而得名。先前的研究發現，亨廷頓病的致病原因是由於位於 4 號染色體短臂的亨廷頓蛋白（HTT）基因上的 CAG 序列的重複擴增所引起，CAG 三核苷酸異常擴增突變產生了變異蛋白質，該蛋白質在細胞內逐漸聚集在一起形成大的分子團並在腦中積聚，影響神經元功能甚至導致神經元死亡，最終出現亨廷頓病症狀。
亨廷頓病患者通常在中年發病，病情呈緩慢進行性加重，平均生存期 10～20 年，臨床主要表現為舞蹈樣不自主動作、精神障礙和進行性痴呆，隨著病情惡化會逐漸喪失說話、行動、思考和吞咽能力，最終導致患者死亡。由於異常亨廷頓蛋白的基因是以顯性的模式遺傳，這也就意味著只要父母其中一方患有亨廷頓病，子女就有 50% 的機率遺傳該病。除此之外，亨廷頓病一般在 40 歲後才會出現明顯症狀，所以當患者發病時很可能已將亨廷頓病的基因傳給了下一代。
亨廷頓蛋白
亨廷頓蛋白（HTT），是一種與亨廷頓病密切相關並在神經系統中高水平表達的蛋白質，約由 3000 個胺基酸殘基組成，其在網格蛋白介導的細胞胞吞、神經轉運過程以及突觸後信號轉導中起重要作用，亨廷頓蛋白基因在出現突變時產生突變亨廷頓蛋白（mHTT）進而導致亨廷頓病。
由於發生突變的亨廷頓蛋白基因包含大量異常的特定 DNA 片段（即 CAG 片段）的重複序列，因此產生的突變 RNA 最終被翻譯成突變亨廷頓蛋白（mHTT）。在這項新研究中，Gene Yeo 與加州大學歐文分校和約翰·霍普金斯大學的研究人員組成聯合團隊聚焦於突變 RNA，並分析了靶向 RNA 的 CRISPR 基因編輯系統是否可以用於靶向與亨廷頓病相關的突變 RNA。
▲圖｜靶向 RNA 的 CRISPR-Cas13d 基因編輯系統的開發過程（來源：Nature Neuroscience）
Gene Yeo 和團隊通過蛋白質工程對 Cas13d 進行改造並開發了一種突變等位基因敏感的、靶向 CAGEX RNA 的 CRISPR-Cas13d 基因編輯系統（Cas13d-CAGEX），該基因編輯系統能夠消除來自亨廷頓病患者的成纖維細胞和誘導多能幹細胞衍生神經元中的 CAGEX RNA。
與此同時，他們還測試了通過腺相關病毒載體（AAV）向紋狀體內遞送 Cas13d-CAGEX 是否會選擇性地降低亨廷頓病小鼠模型中的突變亨廷頓蛋白 mRNA 水平以及蛋白質水平。
紋狀體
紋狀體是大腦基底神經節之一，其核心功能是維持肌肉的正常張力，以及在肌肉運動時保持肌群的協調和相對穩定，協調各種精細複雜的運動。
通過動物試驗發現，Cas13d-CAGEX 向紋狀體的遞送改善了小鼠的運動協調性，減輕了紋狀體萎縮並減少了突變亨廷頓蛋白聚集體。這種方法不僅能夠精準靶向和破壞突變 RNA 分子並且清除了有毒的蛋白質的大量積累，而其他人類基因的表達通常不會受到該方法的影響。
▲圖｜Cas13d-CAGEX 對亨廷頓病小鼠模型的治療效果（來源：Nature Neuroscience）
「這些表型改善持續了至少長達 8 個月的時間，沒有產生任何不良影響，並且脫靶轉錄組效應也非常小。總而言之，我們證明了靶向 RNA 的 CRISPR–Cas13d 基因編輯系統可以作為治療亨廷頓病的一種新型療法。此外，還有非常重要的一點，這種療法對於治療其他顯性遺傳疾病也具有參考意義。」Gene Yeo 說道。
Gene Yeo 表示，他們開展這項研究的目標是設計一種治療方法只針對導致亨廷頓病的突變 RNA 並能夠保證人類基因組和轉錄組的其餘部分不受影響。以 CRISPR-Cas13d 為例，這是一類由 RNA 介導的靶向 RNA 的基因編輯技術。前期研究發現，CRISPR-Cas13d 系統已經被證明可以在哺乳動物細胞中對靶 RNA 進行高效且特異性地敲低。
相較於 Cas9 介導的 DNA 編輯技術，基於 Cas13d 的 RNA 編輯工具靶向動態轉錄的 RNA，不會對基因組造成永久性改變，而且可以通過劑量調整等方式控制 RNA 編輯效果，具有可逆性，相對較為安全。「使用靶向 RNA 的 CRISPR 酶可能比使用靶向 DNA 的 CRISPR 酶更為安全。」Gene Yeo 指出，「若是靶向 RNA 的 CRISPR 酶引起了一些副作用可以隨時停止給藥，並且其產生的副作用是完全可逆的，然而靶向 DNA 的 CRISPR 酶則可能會導致患者基因組出現不可逆的非特異性和非預期的修飾。」他補充說。
總的來說，這項新研究通過開發出靶向 RNA 的 CRISPR-Cas13d 基因編輯療法並在亨廷頓病小鼠模型中驗證了有效性和安全性，為接下來治療亨廷頓病新型基因編輯療法的開發提供了新的思路和理論基礎。
基因療法是目前治療亨廷頓病主要手段
亨廷頓病與阿爾茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、肌萎縮性側索硬化症（ALS）並稱為四大神經退行性疾病，其發病機制較為明確，然而開發有效的亨廷頓病治療方法仍然具有很大挑戰性，雖然目前有些藥物可以減輕一些症狀但無法改變疾病的發展進程。
此前，反義寡核苷酸（ASO）藥物曾被視為治療亨廷頓病的新治療手段，然而隨著去年 3 月，羅氏、Wave Life Sciences 等公司相繼停止了 ASO 藥物的臨床試驗，ASO 治療亨廷頓病的研究暫時被擱置，當然，這倒不能否認 ASO 藥物治療亨廷頓病的可能。
相較之下，基因療法可以將外源正常基因導入靶細胞從而糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，特別是針對神經退行性疾病。根據投資銀行 Cowen 的統計，截至 2021 年 1 月已披露的臨床前或臨床階段基因治療項目中大約有三分之一是針對神經系統疾病，其中，亨廷頓病是基因療法的熱門方向之一。
作為常染色體單基因顯性遺傳病，亨廷頓病是由亨廷頓基因序列突變導致，發病機制相對清晰。從理論上講，阻斷致病蛋白活性、阻止致病蛋白生成或者降解致病蛋白是緩解亨廷頓病症狀的方法，其中通過基因療法降低突變蛋白表達被業界寄予厚望。
然而事實卻不盡如人意。今年 6 月，荷蘭基因治療上市公司 uniQure 公司宣布其在研基因療法 AMT-130 在治療亨廷頓病的 1/2 期臨床試驗低劑量組結果積極，在接受治療 12 個月後患者腦脊液中的突變亨廷頓蛋白（mHTT）的水平降低了 53.8%。僅僅時隔兩個月，該公司在報告中披露，在針對亨廷頓病的 1/2 期臨床試驗中，接受高劑量治療的 14 例患者中有 3 名患者出現了嚴重的副作用，隨後該公司決定暫停高劑量組給藥。
據 uniQure 聲稱，由於低劑量組沒有報告與 AMT-130 相關的嚴重不良事件，高劑量組並不會影響到正在進行的 1/2 期低劑量組試驗，也不影響其數據的讀取。該公司預計相關數據將在 2023 年再次公布。
據悉，AMT-130 治療亨廷頓病的 1/2 期臨床研究是一項在美國進行的雙盲、隨機和對照臨床試驗，該公司表示這也是第一個進入臨床試驗的亨廷頓病一次性基因療法。
（來源：公司官網）
據了解，AMT-130 是 uniQure 公司開發的一款候選基因療法，通過 AAV5 載體包裹人工合成 micro-RNA 進入體內。AMT-130 可以直接注射到大腦的紋狀體區域，最後擴散到大腦的其他部位，旨在降低亨廷頓蛋白的產生突變亨廷頓蛋白（mHTT）來減緩亨廷頓病的病情發展。此前該基因治療已被 FDA 和 EMA 相繼授予授予孤兒藥資格認定，並且也是首個獲得孤兒藥資格認定用於治療亨廷頓病的 AAV 基因療法。
無獨有偶，今年 8 月，拜耳的全資子公司 Asklepios 宣布在法國已獲准進行 BV-101 針對亨廷頓病基因療法的 1/2 期臨床試驗。據悉，BV-101 是一種新型腺相關病毒載體的基因療法，可同時解決患病神經元的代謝功能障礙並有助於清除突變亨廷頓蛋白。
就現階段而言，基因療法是治療亨廷頓病的主要手段。在目前進展比較快的兩種基因療法中，uniQure 公司的技術路線是通過選擇沉默亨廷頓蛋白（HTT）基因來達到治療效果，而 Asklepios 公司則是遞送 CYP46A1 基因來進行治療，這兩種基因療法現在都還處於臨床早期階段，其最終療效如何還有待進一步驗證。
參考資料：
1.https://doi.org/10.1038/s41593-022-01207-1
2.https://www.genengnews.com/topics/translational-medicine/crispr-targets-rna-behind-huntingtons-eases-symptoms-in-models/
3.https://alleninstitute.org/about/team/staff-profiles/gene-yeo/
4.https://baike.baidu.com/item/%E4%BA%A8%E5%BB%B7%E9%A1%BF%E7%97%85/10377104?fr=aladdin&fromtitle=Huntington%E7%97%85&fromid=10125542
5.https://baike.baidu.com/item/%E7%BA%B9%E7%8A%B6%E4%BD%93/6018382?fr=aladdin