本文來自微信公眾號：X-MOLNews
生物正交化學反應是指能夠在生物體系中進行且不會與天然生物化學過程相互干擾的一類化學反應，它為科學家對生命進程的原位研究帶來了革命性的技術，已經成為化學生物學這一新興交叉領域的核心方向之一，也因此於2022年獲得諾貝爾化學獎。其中四嗪參與的生物正交反應——逆電子需求的Diels–Alder（IEDDA）反應，以其超快的反應速率、溫和的反應條件和極好的生物相容性，被廣泛應用於蛋白質的化學修飾以及生物醫學的研究，對該反應的精確調控也具有著重要意義。然而，目前的調控方式大多局限於光催化或電化學的手段，對生物體具有毒性，且操作不便。因此，對四嗪的反應活性進行簡便、無毒且高效地調控，是亟待解決的科學難題。
針對以上問題，2023年6月15日，北京大學藥學院劉濤教授（點擊查看介紹）課題組與南方科技大學蔣偉教授（點擊查看介紹）課題組在Chem 雜誌在線發表研究論文，報導了超分子萘管識別四嗪並調控其生物正交反應活性的策略。在這項工作中，劉濤團隊基於自己之前使用超分子主體靶向蛋白表面以胺基酸側鏈形式存在的客體的研究（Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 11196），以及蔣偉團隊發現的能與苯基嘧啶有高親和力的超分子萘管（CCS Chem. 2020, 2, 1078–1092），開發了四嗪生物正交反應的超分子調控策略（圖1）。該策略通過萘管主體與四嗪客體的分子識別來調控四嗪的生物正交反應活性。萘管能以高親和力識別各種生物分子上的苯基四嗪，從而以可逆的方式有效地抑制它們的生物正交反應活性。這種策略簡便高效且生物相容性極好，有望擴展四嗪化學的應用。
圖1. 超分子萘管調控四嗪生物正交反應示意圖
首先，鑑於萘管和苯基嘧啶有高親和力，作者測試了一系列不同取代基的四嗪分子與順式反式兩種萘管的親和力，發現苯基四嗪與反式萘管有高親和力（~10-7 mol-1）（圖2A,B）。DFT計算發現反式萘管和苯基四嗪結構有良好的相互作用，解釋了該親和力（圖2C）。接下來通過停留光譜儀測定其與最常用的親二烯體——反式環辛烯的反應速率，發現該結合能夠有效抑制四嗪的反應活性（~99.9%）（圖2D,E）。
圖2. 萘管和不同取代基的四嗪的分子識別及反應活性調控
然後，對於不同生物分子上修飾的四嗪，作者探索了這種結合是否還能夠調控四嗪反應活性。他們嘗試了糖、胺基酸、核酸的四嗪偶聯物，發現其與反式萘管間仍然存在高親和力，並且這種分子識別也能夠調控這幾種生物分子上四嗪的生物正交反應活性（圖3A,B）。鑑於四嗪修飾的螢光分子有未反應時保持自淬滅的效果，並且已經廣泛運用於細胞標記等領域，作者又嘗試將IEDDA反應中的親二烯體偶聯到生物分子上，通過主客體識別調控四嗪螢光分子的IEDDA反應活性（圖3C）。為了實現可逆的調控，作者開發了一系列與反式萘管有更高親和力的競爭性小分子，希望這些小分子的加入可以恢復被包籠四嗪的反應活性（圖3D,E）。實驗結果也證明了該體系能迅速且徹底地對四嗪的反應活性進行抑制或恢復（圖3F）。這表明該體系可以實現四嗪生物正交反應在多種生化分子（包括螢光分子、糖、胺基酸、核酸和蛋白質）上的可逆調控。
圖3. 生物分子修飾的四嗪的分子識別與反應活性調控
通過將四嗪做成胺基酸側鏈的形式，四嗪胺基酸可以被基因編碼、參與蛋白質的翻譯，實現對蛋白質的定點四嗪修飾，且四嗪胺基酸pPTet和mPTet也被證明與反式萘管有高親和力（圖4A,B）。以super folder GFP為模型，作者將不同位點突變成四嗪胺基酸，通過分子對接的理論計算發現，萘管只能識別在蛋白表面充分暴露在溶劑中的「站式」四嗪胺基酸，而不能識別貼在表面的「躺式」四嗪胺基酸，而二者本身都具有生物正交反應活性（圖4C,D）。萘管與不同位點突變的蛋白的親和力測定實驗驗證了這一點（圖4E），且發現某些位點的四嗪胺基酸，其臨近的胺基酸也可參與到與萘管的相互作用，從而提高親和力（圖4F）。
圖4. 計算輔助的基因編碼的四嗪胺基酸與萘管在蛋白表面的分子識別
接下來，作者驗證了這種分子識別對蛋白表面基因編碼的四嗪胺基酸反應活性的調控。通過測定不同位點處四嗪胺基酸在不同體系下的反應速率，發現萘管的加入可以高效地抑制「站式」四嗪的反應活性，而競爭性小分子的加入可以高效地恢復其反應活性（圖5A-E）；與此同時，「躺式」四嗪胺基酸不受調控元件的影響。因此，作者設想可通過先對「站式」四嗪胺基酸的包籠，讓「躺式」四嗪胺基酸先進行生物正交反應，然後通過競爭性小分子的加入，讓「站式」的四嗪胺基酸脫籠，並參與新的分子介導的生物正交反應，即「順序IEDDA反應策略」（圖5F）。通過在GFP上反應多種組合的親二烯體接頭，比如降冰片烯和反式環辛烯的聚乙二醇，該設想都得到了證明（圖5G）。這種順序IEDDA反應可以實現在插入多個四嗪胺基酸的蛋白質中進行快速定點的生物正交反應多修飾。
圖5. 基因編碼的四嗪胺基酸在蛋白質上通過順序IEDDA反應實現快速定點多標記
鑑於抗體藥物偶聯物（Antibody-drug conjugates, ADC）廣泛應用於臨床治療，且因抗體蛋白穩定性差，溫和快速的IEDDA反應十分適用於製備抗體小分子偶聯物。因此這樣的順序IEDDA反應首先應用於對於抗體的溫和快速多標記。作者希望製備定點修飾的長效螢光抗體以及螢光抗體藥物偶聯物（圖6A），於是選取trastuzumab的scFv作為模式蛋白，首先通過分子對接的理論計算找到了其蛋白表面兩種性質的四嗪胺基酸突變位點——一種能使胺基酸與萘管結合，一種不能（圖6B）。實驗都證明了這兩種位點的性質（圖6C）。通過表達這兩個位點都插入了四嗪胺基酸的抗體並進行順序IEDDA反應，作者製備了定點修飾的長效螢光抗體（兩個位點分別修飾聚乙二醇與螢光分子TAMRA）以及螢光抗體藥物偶聯物（分別修飾螢光分子TAMRA和毒素MMAE）並表徵了其活性（圖6D,E）。這表明順序IEDDA反應的策略可實現抗體精準多位點修飾及抗體藥物螢光雙偶聯。
圖6. 順序IEDDA反應的策略實現抗體精準多位點修飾及抗體藥物螢光雙偶聯
四嗪與反式環辛烯的IEDDA反應由於其溫和快速的特點，被廣泛應用於活細胞的標記。而超分子調控元件萘管等也具有極好的生物相容性。因此作者設想通過細胞自身表達多種含四嗪胺基酸的蛋白，順序IEDDA反應可以實現對於同一活細胞內多種蛋白迅速且溫和的定點修飾、標記與成像（圖7A）。首先作者驗證了該體系可對細胞膜蛋白表面四嗪的反應進行調控（圖7B）。接著作者選取了兩種蛋白，一種是錨定在膜表面的mCherry，在上面選取了能與萘管結合的四嗪胺基酸突變位點，一種是組蛋白，選取了不能與萘管結合的四嗪胺基酸突變位點，並通過與反式環辛烯的螢光染料反應驗證了性質（圖7C,D）。然後作者先通過mCherry四嗪的包籠，讓組蛋白上的四嗪參與反應，然後進行mCherry四嗪的脫籠並參與另一種螢光分子的反應，進行了共聚焦成像，兩種螢光分子分別定點標記了兩種蛋白質（圖7E）。這證明了順序IEDDA反應可以實現活細胞多靶點定點高效成像。
圖7. 順序IEDDA反應實現活細胞多靶點高效成像
四嗪IEDDA反應速率很高，這使得它可以用於活體內的反應。萘管也具有極好的生物相容性並曾用於小鼠活體實驗（CCS Chem. 2022, 4, 1977–1989）。因此，本文也進行了在活體內實現四嗪生物正交反應活性調控的實驗。通過向小鼠注射表面修飾四嗪的細胞和萘管，尾靜脈注射反式環辛烯螢光染料和競爭性小分子，細胞上四嗪的生物正交反應得到了良好的調控（圖8）。這證明該體系可用於小鼠活體內實現四嗪生物正交反應活性的可逆調控。
圖8. 小鼠活體內實現四嗪生物正交反應活性的可逆調控
總結
該工作開發了一種基於超分子主客體識別的四嗪生物正交反應活性調控策略，該策略通過萘管主體與四嗪客體的分子識別來調控四嗪的生物正交反應活性。萘管能以高親和力識別各種生物分子上的苯基四嗪，從而以可逆的方式有效地抑制它們的生物正交反應活性。這種調控方式對於一系列包含四嗪的生化分子以及複雜環境下仍然適用。並且通過順序IEDDA反應的策略，該調控體系可用於製備定點修飾的長效螢光抗體以及螢光抗體藥物偶聯物、對同一活細胞內多種蛋白迅速且溫和的定點修飾與標記。這種策略生物相容性好，操作便捷，有望擴展四嗪化學的應用。
北京大學藥學院劉濤教授為本文的通訊作者。南開大學聯合培養2015級博士生（已畢業）曹文兵、北京大學藥學院2018級六年制學生王浩宇、深圳大學材料學院副研究員權茂為本文共同第一作者。團隊成員李雨軒、蘇曄宇、李雨航，南方科技大學蔣偉教授，天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室平台指導老師張曉輝和師曉萌以及北京大學醫學部實驗動物科學部指導老師趙禕潔也對該工作做出了重要貢獻。該工作得到了國家自然科學基金（92156025, 92253301和U22A20332）、國家重點研發計劃（2022YFA0912400和2021YFA0909900）和北京市自然科學基金（JQ20034）的支持。
Reversible control of tetrazine bioorthogonal reactivity by naphthotube-mediated host-guest recognition
Wenbing Cao, Haoyu Wang, Mao Quan, Yuxuan Li, Yeyu Su, Yuhang Li, Wei Jiang, Tao Liu*
Chem, 2023, DOI: 10.1016/j.chempr.2023.05.034
劉濤教授簡介
劉濤，博士，北京大學藥學院長聘研究員，博士生導師，分子與細胞藥理系主任，天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室PI，化學生物學交叉中心PI，北大醫學-惠大基因密碼子創新聯合實驗室負責人。國家高層次青年人才、國家優秀青年科學基金獲得者、北京市傑出青年基金獲得者。任中國醫藥生物技術協會委員合成生物學分會委員，中國生物醫學工程學會青工委委員，獲中國藥學會以嶺生物醫藥青年獎，拜耳研究員獎，首屆屠呦呦青年學者獎，北大王選青年學者獎等。以通訊作者身份在Nat Chem Biol、Mol Cell、Nat. Commun、Sci Adv、Chem、JACS、Angew Chem等國際高水平期刊發表一系列研究論文。擔任Journal of Molecular Biology編委，Chinese Chemical Letter編委等。研究集中在蛋白質藥物化學修飾，基因編輯與細胞治療，發展了含有人造胺基酸的蛋白質創新藥物，應用在腫瘤及細胞治療等多種領域，從而促進了生物藥物的升級換代。
https://www.x-mol.com/university/faculty/49942
蔣偉教授簡介
蔣偉，博士，原南方科技大學化學系、雙聘教授，博士生導師。國家傑出青年基金獲得者、國家優秀青年基金獲得者、國家高層次青年人才、英國皇家化學會會士、深圳市「鵬城學者」特聘教授。獲中國化學會「青年創新學術講座獎」，大環芳烴超分子化學「學術新星獎」，德國先令基金會「先令獎」等。以通訊作者身份在Nat. Chem.、Nat. Commun.、JACS、Angew. Chem. Int. Ed.、CCS Chem.等國際高水平期刊發表一系列研究論文。擔任Chinese Chemical Letter青年編委、中國化學會高級會員等。研究集中在仿生分子識別，新型大環主體開發，並將其應用於環境污染物檢測與治理、ee值光譜測量、神經毒氣的解毒、藥物增溶、分子機器、智能材料等多種領域。
https://www.x-mol.com/university/faculty/26767