«——【·前言·】——»

近年來，孟加拉國的積雪草種植受到了嚴重的威脅——枯萎病，病原菌為馬鐮刀菌，已經成為該地區主要的作物病害之一。

人們意識到，只有深入了解馬鐮刀菌的生長和生理特性才能更好地控制和預防這種疾病，因此他們分離了來自孟加拉國的馬鐮刀菌，並對其進行了全面的營養生長和分子鑑定研究。

通過分析不同的培養基和環境因素，研究人員們測定了馬鐮刀菌的最佳生長條件。

結果表明馬鐮刀菌在營養鹽豐富的培養基上生長迅速，並且在5%至10%的氧氣水平下表現最好，溫度和PH值對其生長也有顯著影響。

針對馬鐮刀菌的分子鑑定研究也得到了開展，研究人員們在分離的菌株中檢測到了多個亞型的ITS序列，並將其與GenBank資料庫中的序列進行比對。

結果表明:這些菌株都屬於同一物種，並且與全球其他地區分離的馬鐮刀菌菌株高度相似。

«——【·「Thankuni」的特徵介紹·】——»

積雪草（Centella asiatica） (L.)是一種蔓性、微香、多節莖、多年生的爬行植物，通常被稱為孟加拉語中的「Thankuni」。

它幾乎分布在世界各地，繁茂於陰暗、濕潤、潮濕的地方，如稻田、河岸等形成了密集的綠色草皮。

其葉子是可食用的，呈黃綠色，細而長的葉柄下，特徵性的腎形、圓形或橢圓形，有七條葉脈，該植物通過其從綠色到紅色的匍匐莖水平生長，並與彼此結合併在地下紮根。

Centella asiatica是一種非常重要的植物，具有廣泛的傳統、藥用和治療價值，並被用作食品、飲料和藥物的來源。

它是用於治療多種疾病的許多複合製劑的關鍵元素，在東南亞地區，它傳統上用於治療許多不同的疾病。

Centella asiatica的化學成分在藥用和營養保健應用中具有非常重要的作用，據信是由於其具有生物活性成分三萜皂苷。

Centella的三萜皂苷由許多化合物組成，包括積雪酸、傷心酸、積雪苷、傷心苷、Brahmoside、centelloside、和cenellicacid等。

由於它們的重要性，它們已被用作評估Centella質量的生物標誌物組分，相對於葉柄和根部，葉子中的植物化學物質濃度最高，它還富含維生素C、維生素B1、維生素B2、維生素A和煙醯胺類胡蘿蔔素。

越來越多的人在尋求藥用植物 Centella asiatica，使得它的種植需求也越來越高，然而它的種植遇到了許多問題，特別是各種微生物引起的疾病，尤其是真菌。

在馬來西亞研究表明，C. asiatica 植物器官中的內生真菌種類較為豐富，以根部的內生真菌數量最多，其次是葉子、匍匐莖和葉柄。

其中 Ceratobasidium sp.、Colletotrichum sp.、C.destructivum、Fusarium solani、Alternaria 和 Curvularia 是影響C. asiatica 生長的主要內生真菌，Colletotrichum spp. 和 Fusarium spp是造成各種藥用植物疾病的最常見的內生真菌。

特別是 Fusarium sp可能會導致 C. asiatica 枯萎病，症狀表現為葉片變褐，葉面出現暗褐色病斑，最終導致葉片乾枯。

利用遺傳學工具如 ITS 序列、限制性片段長度多態性（RFLP）、隨機擴增多態性DNA（RAPD）和小亞單位核糖體DNA（rDNA）等，對病原真菌的遺傳和表型特徵進行評估，有助於區分不同真菌種類。

在所有的工具中，基因組DNA中的ITS區域對於病原真菌的鑑定更為有用，rDNA的ITS區域被認為是物種間甚至是菌株間變異性最高的區域之一。

樣品採集來自於Jahangirnagar大學校園內的不同地區的Centella asiatica有枯萎病的植物。

為避免二次感染，採集的病樣分別裝在無菌聚乙烯袋中，然後將這些樣品放入孟加拉Dhaka的Jahangirnagar大學菌物學和植物病理實驗室，繼而進一步進行調查。

«——【·馬鐮刀菌在不同營養條件下的生長表現·】——»

使用組織植株法分離出真菌，將感染的C. asiatica部位切成約0.5厘米長的小塊，以包括受感染和未感染的組織，然後使用NaOCl（5％）溶液進行消毒5分鐘，並用蒸餾水多次沖洗。

四個樣品碎片被放入PDA培養基中，在25℃±2℃的12/12小時黑暗和光照條件下孵育10天。

生長的真菌菌落的菌絲生長被轉移到新鮮的PDA平板和PDA斜線上，以獲得純種，通過觀察其菌落形態、菌絲和分生孢子等形態學特徵，在顯微鏡下對分離的真菌進行鑑定。

使用了8種不同的培養基：蔗糖葡萄糖瓊脂（SGA），酵母提取物瓊脂（YEA），蜜糖腖瓊脂（HPA），麥芽糖瓊脂（MA），胡蘿蔔瓊脂（CA），馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），蜜糖瓊脂（HA）和馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA），用於根據Sultana等人的方法評估病原體的菌絲生長情況。

在自動化程序之前，將培養基調至pH 6.5，在孵箱中保持不同溫度（15℃，20℃，25℃，30℃和35℃）的PDA上的菌絲生長，記錄接種後7天的菌絲生長。

使用不同的pH值（5.0，6.0，7.0，8.0和9.0），將培養基調至pH 4、5、6、7和8，然後在30℃孵育7天，根據Alam等人的方法，在每個培養皿上測量菌絲的徑向生長。

在顯微鏡檢查之後，使用Invent Technology提供的商業服務進行分子特徵化，真菌基因組DNA樣品是用Maxwell Cell Kit 提取的。

使用ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5 (5'-GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3')引物進行PCR反應，在25μL反應體系中，使用20ng基因組DNA作為模板，添加帶有LA Taq (TAKARA BIO INC，日本)的反應混合物。

熱循環反應條件為94℃活化Taq聚合酶1分鐘，35個循環，每個循環包括94℃30秒，55℃30秒和72℃5分鐘；最後在72℃下延長10分鐘。

擴增的PCR產物在1 × TAE緩衝液中以100V的電場力在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，使用1kbDNA標記物作為大小標記物，並在EtBr溶液（0.5μg/mL）中染色。

純化的PCR產物被雙向測序，DNA序列被BioEdit和MEGA6檢查。

進行最大似然（ML）、鄰近加入（NJ）和最大簡約法（MP）分析，並根據1000個bootstrap重複進行了分支的穩健性分析，max-trees設為1000，使用停止標準推斷出重複次數，接受大於60％的引導值。

«——【·馬鈴薯鐮孢菌的形態特徵·】——»

在馬鈴薯鐮孢菌中，空氣生菌絲豐富並呈粉紅色或白色，培養基中出現淡紫色至紫色的色素，菌落中心通常有重度色素沉積，子囊殼不明顯。

微小分生孢子在多孔體的假頭或鏈條中非常豐富，在單孔體中不太常見，主要是5個隔室的橢圓形、類卵形分生孢子，底部截形，呈橢圓形。

大分生孢子極其稀少且難以找到，但存在時，它們通常是三個隔室，形狀為棒狀，頂端細小，基部形狀不良好的足形。

通過討論培養基、溫度和PH值對馬尾桿菌菌絲生長的影響，研究結果顯示在不同培養基中，PDA培養基對馬尾桿菌的菌絲生長有最好的促進作用，而HA培養基則有最差的效果。

實驗中還發現，適宜的溫度也會影響馬尾桿菌的生長，30℃的溫度是其生長最佳的條件，而高於或低於該溫度都會影響其生長，溫度對真菌的生長和發育都有著重要的調節作用。

pH值對馬尾桿菌菌絲生長的影響，在實驗中，將試驗板放在不同的pH值下觀察，發現在pH 7的條件下，馬尾桿菌的菌絲生長最好，其次是pH 8和pH 6，而在pH 8和pH 9下，馬尾桿菌的菌絲生長則較差。

相似的研究還有許多，例如早期的研究發現，某種真菌在pH 7.5下生長最佳，這些結果表明：pH值是影響真菌生長的一個重要因素，可作為真菌分類鑑定的依據之一。

«——【·分子鑑定·】——»

分子生物學技術在真菌分類鑑定中的應用，通過PCR擴增ITS區域，並測序得到了馬尾桿菌ITS區域大小為535個鹼基，可將其與其他物種進行區分。

利用ITS區域可以在較低的分類水平上識別和鑑定真菌物種，因為ITS區域是真菌間變異最大的區域之一，即使在同一物種不同菌株之間也存在較大差異。

Centella asiatica 枯萎病的研究通過傳統真菌分類學和分子特徵鑑定，確定其致病菌為馬尾桿菌（Fusarium equiseti）。

實驗中發現，PDA培養基是F. equiseti 菌絲生長和發育的最佳培養基，最適宜的生長溫度為30°C，最適pH為中性條件。

通過PCR擴增ITS區域，並與NCBI資料庫中36個真菌分類進行比較得出，F. equiseti和其他6個曾被鑑定的 F. equiseti 物種之間的同源性在98%至100%之間。

«——【·啟示與展望·】——»

從孟加拉國積雪草枯萎病中分離出的馬鐮刀菌，我們通過傳統真菌分類學和分子特徵鑑定確定了該致病菌的種類。

實驗結果表明：該菌在PDA培養基上能夠良好地生長和發展，最適生長溫度為28°C，最適pH為5.5。

通過PCR擴增ITS區域，並與NCBI資料庫中的相關菌株進行比較，我們發現該馬鐮刀菌與同種菌株之間的同源性非常高，這表明ITS區域可以作為真菌物種識別和分類鑑定的有用工具。

研究結果對於積雪草枯萎病的防治具有一定的指導意義，我們建議農民們在種植積雪草時要注意對土壤和環境的管理，儘量減少病害的發生。

同時，我們也呼籲更多的科學家和農業工作者加入到病害防治的研究中，共同努力保障農業生產的健康發展。

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