«——【·前言·】——»
小麥是一種重要的糧食作物，對世界糧食安全有著重要的影響。
小孢子是小麥的重要生殖細胞，其生胚誘導和綠色植物再生技術的研究，能夠促進小麥產業的發展。
在生胚誘導和綠色植物再生技術中，溫度是一個重要的因素，冷熱休克對小孢子生長和植物再生能力具有一定的影響。
因此，本研究旨在探究冷熱休克對小麥小孢子生胚誘導和綠色植物再生的差異影響，為小麥生產提供科學依據。
在用於小孢子培養的多個已發布方案中，幾乎所有方案都採用一些類型的應激處理。
將小孢子從天然指定的花粉形成途徑轉換到一種替代的發育途徑，引發體外發生，應激處理可能是不同的，包括冷熱休克、糖飢餓和誘導化學物。
被處理的外植體類型也可能不同，包括栽培植株、離櫱、穗、小花、莢泡和孤立的小孢子，長期以來，冷休克已被認為對穀類作物中的莢泡培養有益。
冷預處理的一般策略涉及在體外培養之前將收集的禾本科草植株以低溫(約4℃)儲存數天，以剪取莢泡進行培養。
在經過冷預處理的莢泡培養中，觀察到高胚塊產量和雙單倍體再生體產生率增加。
也有研究證實，將大麥禾本科草植株存放在4℃的冰箱中長達4周，以提高小孢子的雙單倍體產生率。
通過熱休克或飢餓處理，似乎會觸發或增強小孢子胚形成。
當剪除的小麥莢泡經受高溫（32℃-34℃）預處理時，觀察到有更高的高胚塊產量。
惡劣溫度和營養飢餓的壓力，導致孤立的菸草小孢子中胚芽的產量增加。
將剪除的小麥莢泡置於33℃的孵化器中處理後，在隨後的小孢子培養中觀察到更高的胚芽產量，但植物再生（PR）和綠色植物（GP）產生率仍然較低。
後來，發現一種聯合熱休克、營養飢餓和誘導化學物的預處理方案，能夠進一步提高小孢子培養的效率。
暴露在0.3M甘露醇中的莢泡進行飢餓處理也能有效誘導小孢子胚形成，高溫休克在單獨與飢餓結合，似乎可以觸發或增強小孢子胚形成。
當剪下的小麥莢泡經過高溫（32℃-34℃）預處理後，觀察到更高的高胚塊產量，由於受到溫度升高的壓力和營養飢餓的影響，孤立的菸草小孢子中的胚芽產量增加。
當剪下的小麥莢泡在33℃的培養箱中進行處理時，在隨後的小孢子培養中，也觀察到更高的胚芽產量，雖然植物再生（PR）和綠色植物（GP）的頻率仍然很低。
後來發現，通過熱休克、營養飢餓和誘導化學物的預處理聯合，可以進一步提高小孢子培養的效率，將花葯置於0.3 M甘露醇中進行飢餓處理也能有效誘導小孢子胚形成。
即使是迄今為止報導的最有效系統，穀類作物小孢子培養中，更低綠色植物百分比或無色生物體，仍然限制了雙單倍體在作物育種中更廣泛的使用。
從小孢子衍生的胚胎體再生出的植株中，白化植株（AP）的比例可以在5%到100%之間變化。
小孢子培養中的再生體中白化植株是常見的，特別是對許多實用育種價值的基因型和後代。
通常認為，高白化植株是由於遺傳或環境因素或兩者的組合，但其基本機制尚不清楚，莢泡培養中綠色植物和白化植物的頻率差異在文獻中有詳細記載。
同時預處理和體外培養中的物理和化學條件也被認為是低綠色植物百分比的貢獻因素之一。
有人認為，文化中的高培養溫度導致質體基因組的缺失，從而導致小麥發芽率的降低，雖然通過基因操作可以增加綠色植物百分比，但該過程複雜而耗時。
通過改變預處理和體外培養環境條件來改善 GP% 的可行方法對作物雙單倍體的生產和利用具有益處。
一旦確定了最佳參數，預處理或體外培養中物理、化學條件的變化易於實施。
由於預處理期間升溫被認為是低GP%的原因之一，而33℃的熱衝擊常用於誘導小孢子胚形成。
值得探究是否這樣的熱衝擊確實對低GP%負有責任，莢泡/小孢子培養中另一個常用的預處理是長時間的冷休克。
實驗的目標有三點：
1.測試不同的低溫預處理相對於33℃熱休克是否能有效觸發小孢子胚胎發生；
2.研究不同基因型是否對冷熱預處理的反應存在差異，如GP%的測量；
3.了解誘導培養期間的溫度變化是否會影響GP%，這些結果有助於提高小孢子培養中的GP%。
«——【·預處理的溫度變化·】——»
基於早期實驗的結果，選擇了三種基因型進行研究，這些基因型的GP%有所不同，Calorwa的GP%最低，Pavon 76次之，Chris最高。
三種基因型的種子均在Enconair（加拿大渥太華）GC-16生長室中培養。
當穗子中部花葯中的大多數小孢子處於中至晚單核期時，進行分別取樣，分別取樣和處理按照方案進行。
對於冷休克預處理，立直的分櫱懸瓶在四個溫度水平的冰箱中孵育：4℃、7℃、10℃和13℃，分別為2、6、10和14天。
然後按照方法分離、收集小孢子並與培養基混合，所有的培養皿都在28℃的培養箱中孵育胚胎體發育。
使用血球計數器計數和估算具有胚性的小孢子數，在每組小孢子培養開始後的40、45和50天記錄每個處理的胚胎體數量。
已轉移到再生培養基中的胚胎體直徑最小達到0.2毫米，每個培養皿中尚未成熟的胚胎體進行估算，不進行轉移進行植物再生。
表中呈現的數字包括已轉移和未轉移的胚胎體數量，對於熱休克預處理，立直的分櫱懸瓶針對Calorwa和Pavon 76在33℃孵育52小時，在Chris上孵育72小時。
基於先前的結果，33℃溫度下的這兩個時間方案被認為對這三種基因型最為有效。
由於33℃預處理下小孢子的細胞分裂和形態分化更快，因此需要在培養開始後的35、40和45天計數和轉移胚胎體進行植物再生。
«——【·小孢子的分離和培養·】——»
在冷或熱休克預處理後立即進行分櫱消毒處理，使用20％的商用漂白劑進行處理，然後將穗子從靴子中取出。
小孢子的隔離、收集、誘導培養和植物再生的與預料中的相似。
為這些實驗，僅使用從33℃預處理中分離的小孢子，大量孵育的小孢子在四個溫度水平下進行胚胎發育：16℃、20℃、24℃和28℃。
由於在每個溫度水平下孵育的小孢子是來自同一樣本池的子樣本，因此胚胎體的百分比應該相同，因此未收集該數據。
當胚胎體直徑達到0.2毫米時，進行計數並將其轉移到再生培養基中，計數和轉移在培養開始後35、40和45天進行。收集PR%和GP%的數據。
«——【·胚胎發育過程中的溫度變化·】——»
孵育分離的小孢子在四個溫度級別下進行胚胎體發育：16℃、20℃、24℃和28℃。
由於在每個溫度水平下孵育的小孢子來自同一樣本池，因此具有胚性的小孢子鑑定率應相同。
當胚胎體直徑達到0.2毫米時進行計數，並將胚胎體轉移到再生培養基中，計數和轉移是在培養開始後的35、40和45天進行的。
所有呈現的數據均為每個處理的四次重複樣品的匯總均值，胚性小孢子鑑定率（EM%）是在培養皿中分裂的小孢子占總小孢子數量的百分比。
由於冷休克小孢子的第一次細胞分裂比熱休克後的小孢子稍晚，因此只使用EM% 的峰值進行比較。
植物再生頻率（PR%）定義為：從實際轉移到再生培養基的100個胚胎體中再生植物的數量。
GP%被計算為綠色植物、再生植物總數的百分比，換句話說，總再生植物數（100%）包括白化和綠色植物。
«——【·溫度休克對胚性發育的影響·】——»
一般而言，經過冷休克後分離的小孢子具有比經過33°C熱休克後分離的小孢子更少的清晰特徵（形狀和細胞組織）。
經過33°C熱休克預處理後分離的胚性小孢子呈現出明確的纖維狀或「星狀」結構。
核向多或少移動到細胞中心，中央液泡由從核周邊向亞皮質質充暴放的胞漿呈放射狀分散。
冷預處理的小孢子的特徵則各異且不那麼明確，在經過3-5天的胚胎體培養後，它們才達到類似於「星狀」結構。
呈明確定義的胚性小孢子，在一周內迅速分裂形成多細胞結構，兩周後形成前胚胎體，四周後形成成熟的胚胎體。
一旦將成熟的胚胎體移植到半固體培養基中，植株在十天內發育出來，其中有些是白化體，有些是綠色植物。
胚性小孢子（EM）、胚胎體、白化體和綠色植物（GP）的計數按照這種發育順序進行。
在不同溫度休克的培養中，與對照組相比，所有較低的溫度水平都能在一定程度上引發小孢子胚胎發育。
4℃和7℃的較低溫度比10℃和13℃能產生更高的EM%，這一趨勢對所研究的所有三種基因型都成立。
冷孵育的最佳時長為6天和10天，對於4℃、7℃和10℃的三個溫度水平中的每一個，6天或10天的孵育都能產生更高的EM%。
14天冷休克時發現EM%較低，2天的孵育產生的EM%最低，13℃的預處理，無論基因型和孵育長度如何，都呈現出較低的EM%。
10天或14天的13℃孵育還導致了更高的污染發生率。
因此，不會對13℃預處理進行PR%和GP%的進一步結果收集，被認為對胚性誘導無效。
在4℃-10℃的溫度範圍內，較低溫度能產生更高的EM%，對於所有三種基因型，與其他冷休克相比，4℃溫度預處理可獲得較高的EM%值。
可是，標準的熱休克仍然產生了最高的EM%，最佳的冷休克方案為這三種基因型產生的EM%平均值為17.3％，34.5％和30.7％。
很明顯，如果只按照EM%進行衡量，熱休克仍然是觸發小孢子胚胎發育最有效的方式。
«——【·溫度休克對胚胎產量的影響·】——»
為了抵消不同培養皿中總小孢子數量的差異，在1×104總小孢子的基礎上進行胚胎體數量標定。
來自各種溫度休克處理的胚胎體數量通常遵循相同的模式，即較高的EM%對應著較高數量的成熟胚胎體。
在冷休克預處理中，4℃的6天和10天孵育得到最多的胚胎體，其次是7℃的6天和10天孵育，然後是同期的10℃。
然而，即使從冷預處理中獲得了最高的胚胎體產量，與來自33℃預處理的胚胎體相比，Pavon 76、Calorwa和Chris的降幅分別達到了31%、57%和69%。
對於所有三種基因型，兩個最有效的冷處理期得出來的結果仍然有些不太符合預期。
«——【·溫度衝擊對植物再生的影響·】——»
由於經過13℃的預處理和孵育期為2天和14天的成熟胚胎體中EM％非常低，它們被排除在再生實驗之外。
由熱衝擊預處理發展的胚體的植物再生率分別為Calorwa、Pavon 76和Chris的35％、61％和63％。
在所有三個溫度水平（4℃、7℃和10℃）和兩個處理期（6和10天）中，來自冷衝擊的胚體的植物再生率均較低。
對於Chris和Pavon 76，植物再生率的差異具有統計學意義，但對於Calorwa則無顯著性差異。
在每個基因型內比較三個冷溫度水平和兩個處理期的植物再生率時，發現沒有顯著的差異，表明它們對冷和熱衝擊的反應不同。
對於Chris來說，在所有的冷衝擊預處理中，GP％沒有統計學差異，並且與33℃的熱衝擊之間也沒有差異。
Chris的GP％始終約為75％，對於Pavon 76，從冷衝擊中獲得了更高的GP％，相對於33℃來說要高。
不同冷衝擊之間的GP％差異在統計上是不顯著的，Calorwa在熱衝擊和各種冷預處理之間表現出最顯著的GP％差異。
33℃預處理的GP％僅為5％，但冷衝擊的GP％為28％- 34％，冷衝擊的GP％比33℃熱衝擊高出五倍）。
Calorwa在所有冷衝擊溫度水平上均表現出五倍增加的GP％。
«——【·胚胎發育過程中的溫度變化·】——»
與28℃的標準溫度相比，胚性發育過程中的所有溫度變化都未被發現有益。
對照組（28℃）產生了最多的胚體，其次是24℃和20℃，16℃產生的胚體最少。
在24℃和28℃之間，以及20℃和16℃之間，胚體的產量和GP％沒有統計學差異，在所有研究的三個基因型中，這個排名是一致的。
在每個基因型內，觀察到在28℃和24℃之間，以及20℃和16℃之間，植物再生和GP％之間沒有顯著差異。
然而，在28℃和24℃孵育產生了比20℃和16℃更高的PR％。在所有四個溫度水平上，GP％沒有顯著差異。
誘導培養過程中的溫度變化似乎比GP％更影響胚體數目和總植物再生。
«——【·結論·】——»
觸發胚胎發生的預處理不僅會影響重新編程進行胚胎發生的微孢子數量，還會影響這些微孢子的胚胎體質量。
儘管不同的基因型對相同溫度的預處理具有可檢測的差異，但從目前的研究中明顯出現了一些與溫度水平有關的通用趨勢。
首先，冷衝擊預處理對微孢子的GP％與更高的聯繫，因此，對於天然容易產生白化病變的基因型，採用冷衝擊是可取的。
其次，對於沒有更高白化病變再生傾向的種質，33℃的熱衝擊仍然更有效地誘導微孢子的胚胎發生，並產生更高的綠色植株產量。
因此，應將這種溫度下的熱衝擊作為小麥微孢子培養的默認預處理方法。
總之，對於對高溫衝擊敏感的基因型和育種品系（因此產生的GP％始終較低），應將溫度範圍在4℃至10℃之間的冷衝擊作為一種可行的選擇，以減少再生植物中白化病變的數量。