有機磷，如有機磷農藥(OPPs)和有機磷阻燃劑(OPFRs)是兩種典型的有機磷化合物，可通過農業面源、生活污水、工業點源排放和事故泄漏等途徑進入水體，造成水環境污染和生態破壞。大量有機磷化合物的分解會導致系統缺氧，大量微生物死亡，影響生態環境的穩定。2022年4月，中國環境科學研究院湖泊環境研究中心，以垂直流人工濕地(VFCWs)為研究對象，於農林科學領域期刊《Chemosphere》（IF=8.943）發表題為《Effect of organophosphate esters on microbial community and proteomics in constructed wetlands and its removal mechanism》，通過微生物組學、蛋白質組學分析，揭示了研究了VFCWs對DDVP的去除效果及機理。
奧維森科技為此提供了微生物組學、蛋白質組學檢測及分析服務。
研究背景
有機磷，如有機磷農藥(OPPs)和有機磷阻燃劑(OPFRs)是兩種典型的有機磷化合物，可通過農業面源、生活污水、工業點源排放和事故泄漏等途徑進入水體，造成水環境污染和生態破壞。DDVP等有機磷農藥在中國和其他國家被廣泛用於除蟲除病，但其難降解部分是進入水體後的持久性污染物，可抑制生物體內的膽鹼酯酶，對生物產生急性毒性。此外，低濃度OPPs可作為藻類生長的磷源，促進藻類生長。但大量有機磷化合物的分解會導致系統缺氧，大量微生物死亡，影響生態環境的穩定。本研究建立了實驗室規模的水源地去除典型有機磷污染物(DDVP)，採用微生物組學、蛋白質組學研究了DDVP在水源地中的遷移轉化，以及對水生植物根系組織細胞蛋白表達的影響。
實驗設計
設置兩組實驗室規模垂直流人工濕地(VFCWs, L ' × W ' × H = 0.25 m × 0.18 m × 0.42 m)系統(圖1)，編號為VFCW-C和VFCW-T。
每3天採集VFCW- C和VFCW- T的進水和出水水樣，測量水質參數（CODCr、TN、TP、NH4+-N、NO3--N等），系統穩定運行後每周測量一次；
系統運行結束後，從反應器的不同截面上收集火山岩樣品，進行微生物組學分析；採集風車草根系作為水生植物樣品，進行微生物組和蛋白質組學分析。
實驗技術
16S rDNA測序 Labelfree定量蛋白質組學
研究結果
1. DDVP在VFCW中的去除性能
DDVP在VFCW中的去除效果如圖2所示。DDVP的總體去除率在60%~90%之間，這可能是對DDVP的去除率主要取決於填料和植物的吸附。此外，本實驗的水溫為20-30◦C, pH值約為7。根據文獻報導，DDVP水解的半衰期為32 h。對比本實驗中水的停留時間為30h，可以看出DDVP在實驗裝置中可能發生自然水解，因此自然水解也可能是VFCW中DDVP的去除方式之一。隨著VFCW體系的穩定，實驗60天後，VFCW中DDVP的去除率趨於穩定，平均去除率約為95.87%。因此，在生物降解、底物和植物吸收的共同作用下，VFCWs能夠長期有效地去除水中的DDVP。
2. DDVP對VFCW同時脫氮除磷的影響
操作過程中VFCW的水質參數去除效率如表1所示。總體而言，DDVP對COD、SRP、NH4+-N和TN的去除率在整個過程中基本穩定，而TP和NO3--N的去除率則受到DDVP的正向影響。VFCW-C和VFCW-T對COD去除率均較高(94.6%)，兩組CWs對COD去除率均較好，平均去除率為93.4% ~ 94.6%。一方面，葡萄糖作為碳源，容易被植物和微生物吸收利用。另一方面，與生活污水相比，模擬進水的碳、氮含量相對較低，碳被微生物更充分地吸收利用。
VFCW-C和VFCW-T對NH4+-N的平均去除率分別為70.4%和76.3%。VFCW-C和VFCW-T對氨氮的平均去除率分別為70.4%和76.3%。加入DDVP後，系統對氨氮的去除率顯著提高，平均去除率提高25.68%。此時濕地的硝化作用增強，氨氮轉化為硝態氮，氨氮去除率提高。DDVP對TN的平均去除率也與SRP相同，表明DDVP可能通過刺激植物生長、加速植物對氮的吸收和利用來提高植物對TN的去除率。
3. 微生物對DVPP的響應
利用高通量測序技術對VFCW-C和VFCW-T的基質和水生植物樣品中的微生物群落進行了分析。每個樣本的OTUs豐度在1116~1865之間，在97%的相似水平下，覆蓋率在96.42% ~ 97.57%之間。VFCW-C的微生物豐富度高於VFCW- T，但Shannon估算的多樣性指數表現出相同的趨勢。
採用主成分分析進一步反映VFCW-C和VFCW-T微生物群落結構的差異(圖3a)。VFCW-C和VFCW-T的細菌群落結構差異顯著，說明DDVP的添加顯著影響了VFCW的微生物群落結構。所以，儘管VFCW-T的多樣性較低，但可能存在大量負責去除DDVP的細菌。
如圖3b-c所示，兩類群在門和屬水平上的微生物群落組成及豐度。從門水平來看，VFCW-C和VFCW-T中最優勢的門是Proteobacteria(33.89%~66.72%)，其次是Actinobacteria(5.23%~16.57%)、Bacteroidetes (3.85%~11.02%)、Chloroflexi (2.72% ~ 12.19%)和Planctomycetes (1.93% ~ 8.22%)，這些門在CWs中較為常見。
VFCW-C和VFCW-T的優勢屬為Massilia，VFCW-C的優勢屬為SM1A02、Denitratisoma、Ferruginibacter和Nitrospira，VFCW-T的優勢屬為Denitratisoma、SM1A02、Chthoniobacter和Rhodobacter。
與對照組相比，Massilia、Tabrizicola、Denitratisoma和SM1A02的相對豐度增加，說明這些屬在VFCWs中對DDVP的清除起重要作用，其中Massilia是關鍵功能屬。
注:C1-C3為火山岩微生物樣品，C4-C6為VFCW-C中植物根際微生物樣品；T1-T6同上。
4. 風車草根系蛋白質組對DDVP的響應
VFCW-C和VFCW-T之間有242個差異蛋白，151個上調蛋白和91個下調蛋白。根據GO注釋分析，與生物過程相關的差異蛋白有13個，與細胞成分相關的差異蛋白有16個，與分子功能相關的差異蛋白有1個。這些結果表明，在DDVP脅迫下，風車草根組織會分泌更多與細胞成分相關的蛋白來抵抗外界環境的變化，並分泌更多與催化活性相關的蛋白來進一步降解DDVP。
KEGG分項的散點圖如圖4所示，這些是非常重要的蛋白質富集途徑。從數量上看，代謝途徑、次生代謝產物生物合成、碳代謝和胺基酸生物合成富集的蛋白質數量相對較高，分別為79、51、24和20個。大多數差異蛋白與細胞代謝有關，如丙酮酸代謝、苯類生物合成、檸檬酸循環(TCA循環)。其他的是蛋白酶體，它可以直接影響一些蛋白質的更新，包括錯誤摺疊蛋白和許多生命活動中的關鍵蛋白，如P53、細胞周期蛋白。因此，這些蛋白的調控將直接影響相關的生物學功能。
綜上所述，DDVP刺激植物代謝過程，增強了與ATP合成和利用相關的代謝過程。另一方面，誘導植物根系分泌水解酶，促進DDVP的降解。說明DDVP的脅迫可能會使風車草改變根細胞中不同蛋白的差異表達來適應環境，從而加強對DDVP的去除。
5. DDVP在VFCWs中的去除機制
基於上述實驗結果，分析了VFCW中DDVP去除的相關機理(圖5)。通過對VFCW-T微生物群落變化的分析，可以推斷Massilia是降解DDVP的主要功能屬，其他功能屬可能包括Tabrizicola、Denitratisoma和SM1A02。植物差異蛋白質組學研究表明，提高風車草合成相關蛋白的表達水平，促進水解酶的分泌，可以加速DDVP的水解過程。同時DDVP及其含磷化合物可作為磷源，參與ATP合成過程，加強植物的能量代謝過程，促進植物生長，間接增強VFCW對其他污染物的去除。此外，DDVP可被VFCW有效去除(94% - 95%)，最終形成可被植物和微生物吸收利用的磷酸鹽，植物根系分泌的磷酸酶和水解酶也能促進DDVP的降解。
注:根系附近紅點為微生物，綠點為DDVP，藍點為根系分泌物。
研究結論
1. 長期運行的CWs對DDVP的平均去除率為94% ~ 95%。此外，VFCWs對可溶性磷酸鹽(SRP)和總磷(TP)的平均去除率為48.60%~64.10%，且DDVP的加入增強了CWs的脫氮效果。
2. 高通量測序結果顯示，Massiilia(2.67%~18.06%)、Denitratisoma(2.07%~3.80%)和SM1A02(2.85%~4.67%)在VFCWs中對DDVP的去除過程中起重要作用。
3. 植物根系蛋白質組學分析表明，A0A3B6ARQ4蛋白(上調差異倍數：29.53倍)和LOC_Os11g38050.1蛋白(下調差異倍數：0.001)對OPEs反應更敏感，說明DDVP增強了植物能量生產和水解酶合成，從而促進其水解。
參考文獻
[1] Lu S, Zou T, Qin P, Zhang X, Wang G, Qin Y, Wang Q. Effect of organophosphate esters on microbial community and proteomics in constructed wetlands and its removal mechanism[J]. Chemosphere. 2023, 319:137803.