RNA m6A甲基化綜述！

RNA甲基化是指在甲基轉移酶的催化下，RNA的甲基腺嘌呤被選擇性地添加甲基基團的化學修飾現象，主要形式為m6A甲基化。m6A甲基化修飾是可逆化的，包括甲基化轉移酶（Writers）、去甲基化酶（Erasers）和甲基化閱讀蛋白（Readers）等共同參與。與人類的發育，免疫，腫瘤生成和轉移，幹細胞更新，脂肪分化等過程息息相關，因此，RNA甲基化已成為科研中一個重要且熱門的研究方向。

圖1

但是這些修飾只發生mRNA的頭部和尾部，關於RNA的內部修飾（internal modification）在許多種類的RNA中都有發生。無論是mRNA還是lncRNA，都大量存在m6A修飾。m6A能夠加速mRNA前體的加工時間，加快mRNA在細胞中的轉運速度和出核速度。除了m6A，RNA上還存在以下常見的幾種修飾，包括m1A，m5C等（圖1）。

已知tRNA上發生鹼基修飾的比例較高，會有各種各樣的鹼基修飾行為。tRNA修飾有助於提高翻譯效率，維持其三葉草摺疊二級結構的穩定性。人類的核糖體RNA（rRNA）上有超過200個鹼基修飾位點，而剪切體RNA（spliceosomal RNA）上也有超過50個鹼基修飾位點。

什麼叫m6A修飾？

如圖所示，m6A就是在腺苷6位的N原子上插入一個甲基取代基。

m6A修飾又有什麼樣的功能呢？

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誰參與了m6A修飾

RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上最為普遍的修飾。目前發現microRNA，circRNA,rRNA, tRNA和snoRNA上都有發生m6A修飾。m6A修飾主要發生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由「編碼器(Writer)」、「消碼器(Eraser)」和「讀碼器(Reader)」決定。「編碼器(Writer)」即甲基轉移酶，目前已知這個複合物的成分有METTL3，METTL14, WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作為去甲基酶（消碼器）可逆轉甲基化；m6A由m6A結合蛋白識別，目前發現m6A結合蛋白（讀碼器）有YTH結構域蛋白（包括YTHDF1, YTHDF2,YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。

PART.1

m6A甲基化轉移酶（Writers）

甲基化轉移酶（methyltransferase）也叫Writers，是一類重要的催化酶，能夠讓mRNA上的鹼基發生m6A甲基化修飾。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1492都屬於m6A甲基化轉移酶的核心蛋白。這些蛋白並不是各自孤立的，而是會形成複合物（complex）共同行使催化功能。由於酵母和線蟲等生物缺少這四種核心蛋白中的一種或幾種，所以m6A甲基化修飾屬於高等真核生物獨有的鹼基修飾反應。

結構生物學研究表明，METTL3和METTL14這兩種蛋白有關鍵的催化結構域，兩者之間會形成雜絡物（hetero complex）。其中METTL3是具有催化活性的亞基，而METTL14會在底物識別上起到關鍵作用。另外WTAP、Vir以及其他類型的factors也是雜絡物的重要組成部分。其中WTAP在招募METTL3和METTL14起到十分重要的作用。這些蛋白無論在體內（in vivo）還是體外（in vitro）都會一起對腺苷酸進行甲基化修飾。除了人和小鼠等哺乳動物，果蠅、酵母甚至擬南芥中也發現了類似的同源蛋白（homologous protein）。

PART.2

m6A去甲基化酶（Erasers）

在真核生物中，已發現的m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5等。FTO蛋白全稱Fat mass and obesity-associated protein，屬於Alkb蛋白家族中的一員並且與肥胖相關。1999年，FTO基因首次在小鼠中被克隆。2007年，三項獨立的隊列研究分別證實當FTO基因產生突變時，會增加肥胖的風險。同樣在小鼠模型中，FTO被敲除或過表達都會顯著改變小鼠的體重。2011年，芝加哥大學何川教授在全球首次證實，無論是在DNA還是RNA中，FTO蛋白都是一種十分重要的去甲基化酶。

FTO蛋白在核心結構域上與Alkb蛋白家族相似，但是C端獨有的長loop與Alkb家族其他蛋白有所不同。正是這種特有的結構域使得FTO蛋白能夠對發生甲基化的單鏈DNA或單鏈RNA進行去甲基化修飾。一旦FTO基因轉錄水平發生異常，會引起多種疾病如急性髓細胞白血病等。

ALKBH5是另一種重要的去甲基化酶，能夠對細胞核中的mRNA進行去甲基化修飾，在N端有丙氨酸富集區和獨有的捲曲螺旋結構（coiled-coil structure）。在細胞系中敲低ALKBH5後，mRNA上m6A修飾水平顯著上升。

PART.3

m6A甲基化閱讀蛋白（Readers）

發生m6A修飾的mRNA想要行使特定的生物學功能，需要一種特定的RNA結合蛋白——甲基化閱讀蛋白，也叫reader。RNA pull-down實驗已經鑑定了多種閱讀蛋白，包括YTH結構域的蛋白、核不均一核糖蛋白（hnRNP）以及真核起始因子（eIF）等。這些閱讀蛋白的功能主要包括特異性結合m6A甲基化區域，削弱與RNA結合蛋白同源結合以及改變RNA二級結構從而改變蛋白與RNA的互作。

具有YTH結構域的蛋白包括YTHDC1-2和YTHDF1-3等。YTHDF1-3主要在胞漿中特異性識別m6A修飾的mRNA，而YTHDC1-2的作用部位主要在細胞核內。這些蛋白都在C端有YTH結構域，並且能夠與m6A motif有重疊從而介導RNA特異性結合，而脯氨酸/穀氨醯胺/天冬醯胺富集（P/Q/N-rich）結構域則與亞細胞定位有關。

eIF3蛋白能夠與RNA 5』端UTR上發生m6A修飾的鹼基相結合，從而促進mRNA的翻譯。這是一種幾乎獨立於傳統的eIF4的激活翻譯起始的新機制，RNA在eIF3的作用下招募43s核糖體在5』端Cap形成蛋白複合物。

HNRNPA2B1作為hnRNP家族蛋白中的一員仍然能行使閱讀蛋白的功能。與YTHDC1蛋白不同的是，HNRNPA2B1與m6A修飾的鹼基不能直接結合。HNRNPA2B1除了激活miRNA初級體（pri-miRNA）下游通路外還與miRNA前體（pre-miRNA）加工有關。

植物中RNA是否也存著m6A修飾呢？

與哺乳動物一樣，植物RNA也存在m6A修飾。大約在40年前，已經有國外的課題組首次在小麥、燕麥、胚芽鞘和玉米的RNA中發現m6A修飾。植物也有屬於自己的甲基化轉移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和甲基化閱讀蛋白（readers）。研究表明，m6A修飾被認為在植物胚胎發育中起著關鍵作用，同時，也參與調節對各種非生物（abiotic）和生物脅迫（biotic stress）的反應。

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