前言
目前臨床上所使用的小分子藥物大部分以蛋白為靶標, 小分子藥物通過與靶標蛋白上的特定位點結合而發揮藥效，然而可成藥的蛋白在總蛋白數中占據較少部分。「不可成藥」蛋白占人體總蛋白的80%。因為大部分的蛋白並沒有合適的藥物結合位點。
在中心法則中, RNA處於蛋白質的上游, 控制著蛋白質的翻譯, 靶向RNA的小分子藥物研究在一定程度上可以解決蛋白「不可成藥」的難題。
本綜述文章總結了近年來靶向RNA小分子藥物研究領域的代表性研究成果, 以及靶向RNA小分子藥物的篩選方法, 並著重分析了靶向新冠病毒RNA的小分子藥物的最新進展。
小分子藥物一直是當前藥物研發的主流方向。在2005~2020年FDA批准的新藥中,小分子藥物的占比在70%~90%。在2020年FDA批准的53個新藥中, 小分子藥物有38個。相比於大分子抗體藥物, 小分子藥物具有許多優點: 給藥方便、可口服、存儲運輸方便、藥物進入細胞後可以很好地作用於細胞內與細胞外的靶點。除此之外, 小分子藥物能透過血腦屏障且幾乎不具有免疫原性, 具有較好的廣譜適應性。小分子藥物在體內與特定的靶點結合後才能發揮藥效, 現有的小分子藥物靶標主要是蛋白質, 但人體內有超過80%蛋白不能成為小分子的作用靶標(如轉錄因子、支架蛋白等), 這些蛋白被稱為「不可成藥」蛋白(undruggable protein), 這導致了與這些蛋白相關聯的疾病很難通過小分子靶向策略進行干預治療。
在中心法則中, 核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)處於蛋白質的上游, 控制著蛋白質的翻譯, 對RNA進行干預可以調控蛋白質的翻譯, 進而間接實現治療疾病的效果, 使一些蛋白「不可成藥」的難題得以解決。RNA是體內的一類大分子物質, 種類繁多, 在遺傳編碼、翻譯、調控和基因表達等多種過程中有重要作用。從脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)轉錄後, RNA會摺疊成不同的二級(鹼基配對)和三級(3D)結構。通過與核糖體上的蛋白形成氫鍵, RNA會形成不同的結構包括螺旋、髮夾環、凸起和假結, 這些結構之間相互作用, 形成更高階的三級結構。這些具有複雜結構的RNA發揮著基因表達調控、催化等許多重要的生物學功能, 這些結構也使得RNA的表面或口袋具有一定的成藥性。
RNA在人類基因組中占比很高, 其中非編碼RNA的序列占到了基因組的70%, 比編碼蛋白質的序列高一個數量級, 這些豐富的RNA結構為小分子藥物提供了豐富的靶標。發展可靶向RNA的小分子藥物是以蛋白為靶標的藥物開發策略的重要補充, 具有更廣闊的應用前景。現有的靶向RNA的療法主要是通過核酸等大分子藥物對編碼RNA進行干擾實現的, 現已批准的該類藥物包括Ionis PharmaceuticALS公司的反義寡核苷酸療法(antisense oligonucleotide, ASO)：Spinraza(nusinersen)和Tegesedi(inotersen), 以及Alnylam Pharmaceuticals公司的小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)療法: Onpattro(patisiran)。除此之外, CRISPR-Cas系統在RNA靶向應用中也取得了一定的研究進展, 比如CRISPR-Cas13d系統。雖然這些療法的特異性較高, 但存在較大的遞送難題, 並且核酸酶敏感, 同時不易在體內分布,在治療過程中也存在較大的安全性和效力的難題。例如, 已獲批用於治療脊髓性肌萎縮症(spinal muscular atrophy, SMA)的反義寡核苷酸藥物Spinraza(nusinersen)必須通過直接注射到脊柱中, 而傳統的小分子藥物則不存在這種障礙, 因此發展可直接靶向RNA的小分子藥物具有很好的前景。另一方面, 隨著新型冠狀病毒的大流行, 目前缺乏有效的治療新冠的藥物, 通過直接靶向新冠病毒RNA阻斷該病毒在體內的複製來開發抗病毒藥物, 成為一種新型藥物研發策略, 受到了不少科學家的關注。
蛋白質由20種不同的胺基酸構成, 具有很高的特異性和辨識度, 但RNA僅由4種核苷酸構成, 因此它們三維結構的複雜度比蛋白質的要低很多, 導致RNA結構沒有很高的特異性。這使得找到一種僅結合單一RNA且無廣泛不良反應的藥物變得困難。同時, RNA的動態結構不斷搖擺, 鑑定其三維結構也具有一定的難度, 這也為基於結構的RNA靶向藥物設計帶來了困難。因此, 以RNA作為靶標的小分子藥物研發仍然是一個難點。2020年8月, Evrysdi(risdiplam,1, 圖1)獲FDA批准上市, 成為第一個獲批上市的靶向RNA的小分子, 隨後Evrysdi在SMA治療市場的份額不斷增加, 2020年第三季度累計銷售額達890萬美元。Evrysdi是由PTC Therapeutics、SMA基金會和羅氏聯合開發, 其獲批具有里程碑意義。該藥物通過直接靶向RNA或RNA-蛋白質複合物起作用, 而不是僅僅靶向與疾病有關的蛋白質。隨後, 多家公司建立了以RNA作為靶標的小分子藥物篩選平台, 以RNA作為靶點的小分子藥物研發逐漸走進人們的視野, 吸引了越來越多的藥物化學家的青睞。本綜述將會對近年來靶向RNA小分子藥物的篩選方法及其領域的代表性研究成果進行介紹。
靶向RNA小分子藥物的篩選方法
目前用於發現可與RNA結合的小分子藥物的方法有很多, 其中篩選是以RNA為靶標的小分子藥物研發的最常見的技術。傳統上, 有兩種方法可以用於篩選小分子: 第一種是基於靶標的篩選,它是通過評估各類小分子對疾病相關的特定靶標(如酶、受體或RNA)的結合力來確定先導小分子的結構;第二種是表型篩選,即通過小分子對細胞或生物體的影響進行評估, 篩選出能產生所需表型的小分子藥物。目前,以RNA為靶標的小分子藥物篩選多採用第一種策略, 基於片段的靶向RNA的小分子藥物篩選方法已經與各種生物物理技術協同實施。比如, 用小分子微陣列(small molecule microarray, SMM)篩選平台以RNA為靶標的小分子庫篩選, 還有許多高通量篩選方法, 包括基於質譜、螢光的方法已經被開發出來, 用於評價RNA與小分子的相互作用。雖然高通量篩選方法仍然很受歡迎, 但新開發的篩選方法, 如基於碎片的篩選、核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR), 均可促進發現新的靶向RNA小分子藥物和新的RNA靶點。NMR可以根據化學位移變化定性地鑑定小分子在核酸中結合位點。通過將這些方法與基因組中RNA二級結構預測研究相結合, 人們可以針對基因組序列中各種未開發的RNA結構快速設計小分子。
除此之外, 信息學的方法也有助於RNA藥物的發現。例如, Disney課題組開發了通過統計不同結構小分子與不同摺疊RNA序列之間的相互作用信息, 來尋找特異性靶向某致病RNA的小分子的方法(Inforna)。通過這種方法, 他們在癌細胞的RNAs中挖掘信息, 結合藥物-RNA序列相互作用的資料庫, 發現了能夠靶microRNA-96的抗腫瘤小分子。基於結構的藥物設計和虛擬篩選策略也已被用於RNA配體對接分析。Aguilar等通過自動配體識別系統(ALIS, 一種基於親和選擇質譜的無偏篩選方式), 鑑定發現了特異性結合Xist的小分子。
靶向RNA小分子藥物的分類
目前, 靶向RNA的小分子藥物已經在抗病毒、抗菌、RNA剪切體及RNA重複片段有著廣泛的應用, 本文將以每個應用類型中的代表性例子進行闡述。
■ 靶向病毒RNA小分子藥物
病毒核糖核酸基因組的翻譯是通過核糖體結合到高度結構化的核糖核酸元件即內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site, IRES)開始的, 這為治療病毒類疾病提供了一個新的靶點。這一結構通常存在於病毒基因組的非翻譯區(untranslated region, UTR)。C型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)核糖核酸的5′-UTR含有一個大的結構域, 作為IRES,C型肝炎病毒複製需要IRES介導的翻譯。赫爾曼實驗室多年來一直在研究以IRES為靶點的C肝藥物, 在靶向RNA的小分子文庫的篩選中, 他們發現了化合物2(圖2), 該化合物可以與IRES區域結合減少病毒複製。Ibis Therapeutics公司通過將小分子庫與質譜篩選方法聯用, 發現了C型肝炎病毒IRES核糖核酸的功能抑制劑: 化合物3和4, 這兩個小分子可以結合在HCV RNA IRES IIA亞結構域, 影響病毒複製和翻譯。
人類免疫缺陷病毒1型(human imrnunedeficiercy virus type 1, HIV-1)是最常見的獲得性免疫缺陷病毒類型, 也是致死性極高的傳染病。目前還沒有能夠治癒愛滋病(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)的藥物, 以HIV病毒的RNA為靶標是很有潛力的藥物開發策略。反式激活應答(transactivation response, TAR)RNA, 是一種位於病毒基因組5′-UTR中的核苷酸莖環RNA, 通過與反式激活蛋白(transactivator, Tat)結合, 促進病毒基因組的轉錄, HIV-1的TAR RNA是研究小分子RNA拮抗劑的一個良好的靶標。Tat是一種病毒編碼的蛋白質, 可以通過招募宿主轉錄機制來促進病毒DNA的有效轉錄, 而TAR RNA則通過與Tat的相互作用在愛滋病毒複製中起著關鍵性作用。Abulwerdi等發現噻吩並吡啶類化合物可以與HIV-1 TAR RNA髮夾結構結合併破壞Tat-TAR的相互作用。篩選發現對TAR髮夾結合親和力最好的化合物5的Kd值49.1 μmol·L-1。Parke-Davis的研究人員使用各種常見的高通量篩選技術篩選出了干擾Tat蛋白與TAR結合的小分子化合物6, 研究中發現該化合物可以選擇性地抑制細胞中愛滋病毒對巨細胞病毒Tat的反式激活。Schneekloth小組在對一個空間排列的小分子文庫進行結構篩選時, 發現了可以結合併抑制愛滋病毒TAR功能的小分子化合物7。
■ 靶向細菌RNA的小分子藥物
在細菌中, 小分子通常結合在細菌基因組的5′-UTR區域含有核糖核酸的調節元件上, 從而來控制mRNA相關蛋白的翻譯水平。這些調節元件被稱為核糖體開關, 而這些小分子通常為代謝產物。核糖體開關包括可以識別並結合配體的保守序列適配體區(aptamer domain, AD), 以及結構多變、可以調控下游編碼基因的表達平台區(expression platform, EP)。迄今為止, 許多發現的抗生素均是以核糖體RNA(ribosomal RNA, rRNA)為靶點, 發揮抑制細菌的生長的作用。目前已有多種靶向核糖體開關的藥物被發現。吡啶硫胺(pyrithiamine, PT)是一種具有抗菌作用的硫胺素類似物, 其靶點是硫胺素焦磷酸(thiamine pyrophosphate, TPP)核糖開關, TPP是丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase complex, PDH)、α-酮戊二酸脫羧酶(oxoglutarate dehydrogenase complex, OGDH)、轉酮醇酶(transketolase, TK)、乙醯羥基酸合成酶(acetohydroxyacid synthase, AHAS)等酶類的重要輔酶。TPP核糖開關負責調控硫胺素合成或轉運相關基因的表達, 當TPP核糖開關被結合時形成轉錄終止子, 硫胺素合成和轉運相關基因的轉錄終止, 信使RNA(messenger RNA, mRNA)生成受到抑制。PT與TPP核糖開關結合抑制細菌硫胺素的合成和轉運, 破壞細菌代謝途徑, 從而起到殺菌作用。天然產物玫瑰黃色素結構與核黃素類似, 能夠與枯草芽孢桿菌的黃素單核苷酸(flavin mononucleotide, FMN)核糖開關結合而抑制細菌生長。Breaker小組(耶魯大學)的實驗室在研究中發現了玫瑰黃酮化合物8(圖3), 一種天然抗菌物質, 它可以和FMN核糖開關結合, 發揮抗菌作用。除此之外, 這個研究團隊還發現了鳥嘌呤、賴氨酸和TPP核糖開關的類似物9~11, 這些小分子均通過與核糖開關結合而抑制其原有的作用過程。Maciagiewicz等在研究中發現惡唑烷酮小分子化合物12, 可以作為T盒核糖開關(T-box riboswitch)的配體使用。默克公司(Kenilworth, NJ)報導了一種可以選擇性地抑制FMN的表達的小分子化合物13(ribocil-B)。這個小分子選擇性抑制FMN的表達, 通過結合併抑制FMN核糖開關起作用, 從而干擾mRNA翻譯。Ribocil是第一個合成的小分子的抗生素, 其具有選擇性, 在結構上與天然配體存在不同。
Blount等研究證明了C4位修飾的賴氨酸類似物L-氨乙基半胱氨酸和L-4-氧代賴氨酸都與枯草芽孢桿菌的賴氨酸核糖開關結合而抑制細菌生長。Kim等在實驗中發現了鳥嘌呤類似物6-N-羥基氨基嘌呤可以作用於鳥嘌呤核糖開關抑制細菌的生長。Mulhbacher等發現6-羥基-2, 4, 5-三氨基嘧啶是通過在鳥嘌呤核糖開關上發揮作用而抑制金葡菌的生長。Batey小組在研究中也報導了嘌呤核糖開關類似物小分子14的合成孔徑雷達(synthetic aperture radar, SAR)。
■ 作用於RNA剪切的小分子藥物
RNA剪切是從DNA模板鏈轉錄出的最初轉錄產物中除去內含子, 並將外顯子連接起來形成一個連續的RNA分子的過程。在真核細胞基因表達的生物過程中RNA剪接起到一個非常重要作用, 許多具有功能的, 帶有編碼信息的mRNA均可通過RNA剪接產生, 它對生物的發育及進化具有重要的意義。據估計, 由於基因突變而導致的疾病中有1/3是由於剪接錯誤造成的。目前針對剪接錯誤造成的一系列疾病的調節治療策略已經被開發, 其中就包括針對肌肉營養不良症和運動神經元疾病的藥物的研發, 雖然一些小分子藥物還處於臨床試驗階段, 而部分藥物已被批准用於商業用途。
SMA是由於運動神經元存活基因1(SMN1)功能喪失和運動神經元存活基因2(SMN2)在人體內的低效剪接導致的SMN蛋白缺乏引起的。小分子化合物口服後可透過血腦屏障, 避免了反覆腰椎穿刺鞘內注射的不便。目前進入早期臨床試驗階段的口服小分子藥物包括兩種, 即branaplam(15,圖4)和risdiplam(1)。Branaplam為Novartis公司研發的調節SMN2基因剪接的口服小分子藥物, 在早期動物實驗中證實了該化合物結合導致SMN2基因更有效的剪接, 從而提高動物體內功能性SMN蛋白的表達水平, 延長了動物存活時間。在研究中發現該小分子藥物通過穩定由SMN2前體mRNA和小核糖核蛋白複合體U1 snRNP形成的瞬時雙鏈RNA結構發揮作用。這一研究結果顯示了小分子介導序列選擇性剪接調節的可行性, 以及在其他剪接疾病中利用這一策略的潛力。
口服的小分子藥物risdiplam是SMN2的剪接修飾劑,該藥能促進SMN2產生全長和功能性的蛋白, 對1型、2型、3型SMA患者的運動功能均有改善效果, 已經在2020年成功上市。而在SMN2相關疾病的其他研究中, 也發現了一些小分子可以發揮一定的效果。如美國公司PTC Therapeutics發現了一種小分子16, 研究發現該類小分子增加了低效剪接的SMN2的產生, 該小分子是第一個進入臨床試驗的小分子剪接修飾物。該藥物正在SMA患者中進行臨床1b/2a期試驗, 但其在長期的動物治療研究中出現了安全性問題。
■ 作用於RNA的重複元件的小分子藥物
RNA重複元件是指重複的非編碼RNA序列的短鏈模式, 通常情況會出現數千次的重複。由於這些核糖核酸重複元件的出現, 會使得體內的蛋白質表達受到影響, 可能會導致機體發生病變。
在米勒實驗室的研究中, 通過動態組合選擇篩選出了小分子17(圖5), 並發現它可以抑制1型肌強直性營養不良症(myotonic dystrophy type 1, DM1)相關的聚(CUG)RNA重複元件與蛋白MBNL1的結合。齊默曼實驗室也發現了另外一個小分子18, 可以抑制蛋白質與聚(CUG)核糖核酸重複序列的結合。Disney實驗室在RNA靶向文庫中發現了可以選擇性抑制DM1中聚(CUG)RNA重複元件的小分子19, 並在Inforna設計平台的幫助下優化了該小分子的細胞活性, 得到了類似分子在細胞中具有功能活性的小分子20。
肌萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)和額顳葉痴呆(frontotemporal lobe dementia, FTD)是進行性神經退行性疾病, 表現為運動障礙以及認知、行為和語言缺陷。ALS和FTD最常見的遺傳原因是基因RNA的poly端中(GGGGCC)重複擴增, 非AUG(RAN)重複擴增翻譯成有毒二肽重複蛋白(toxic dipeptide repeat proteins, DPRs)與核糖核酸病灶的形成以及該疾病的病症具有直接的相關性。Ursu等研究中, 在一個包含3 271種具有藥物樣特性的富氮雜環化合物的分子庫中, 通過高通量篩選將苯並咪唑衍生物小分子21識別為特異性r(G4C2)8黏結劑, NMR結構研究表明, 該小分子可以選擇性地結合到重複的GG內部環結構5′CGG G/3′GGC上。且該小分子選擇性抑制C9ALS/FTD HEK293T細胞模型RAN翻譯和減少聚(GP)DPRs的產生而不影響r(G4C2)66mRNA水平。
■ G-四鏈體結構
G-四鏈體(G-quadruplex)是由富含串聯重複鳥嘌呤(G)的DNA或RNA摺疊形成的高級結構。G-四分體(G-quartet)是四鏈體的結構單元, 由Hoogsteen氫鍵連接4個G形成環狀平面, 兩層或以上的四分體通過π-π堆積形成四鏈體。除了人體中RNA G-四鏈體還存在於一些細菌和病毒中, 包括HIV、單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)、人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus, HPV)、EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)和HCV。一些G-四鏈體特異性化合物通過靶向G-quadruplex結構顯示出強大的抗病毒活性, 因此, G-四鏈體特異性化合物可能是潛在的抗病毒藥物。
由此可見, G-quadruplex具有很好的靶標開發潛力, 雖然已有數千個內源性RNA序列被證實可以在體外摺疊成G-quadruplex, 但這些結構能否在細胞中摺疊成為G-quadruplex, 尚需在細胞中進行表徵。Schneekloth實驗室使用了一個親和選擇篩選平台, 篩選了與MYC原癌基因的啟動子中特徵明確的DNA G4基序結合的小分子。對這些分子進行了優化, 得到了能夠選擇性抑制細胞中MYC表達的小分子22(圖6)。雖然該分子靶向DNA G4結構, 但這些研究結果也有望應用到結構相似的RNA G-quadruplex。
Miglietta等研究中, RAS癌基因在許多人類癌症中過度表達, 而目前還沒有抗RAS藥物到達臨床。在報告中介紹了一種通過小分子與mRNA的5′-UTR中的RG4s結合來抑制胰腺癌細胞中kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS)癌基因的策略。利用G-quadruplex預測軟體, 在5′-UTR區域鑑定了一個假定的G-quadruplex基序, 該基序與莖環結構平衡存在, 並且發現小分子23可以改變這種平衡, 從而抑制了KRAS翻譯。當給予胰腺癌細胞時, 該分子降低KRAS蛋白水平, 並抑制細胞生長和集落形成。在Katsuda及其同事的一項研究中, 確定了一種小分子24, 其可以靶向NRAS原癌基因中的5′-UTR G-quadruplex。在乳腺癌細胞系中, 使用該小分子治療可以使NRAS蛋白表達顯著降低。
■RNA靶向降解嵌合體(ribonuclease targeting chimeras, RIBOTAC)技術
基於泛素化-蛋白酶體系統降解途徑的蛋白質靶向降解嵌合體(proteolysis targeting chimera, PROTAC)作為新穎的誘導蛋白降解方式已成為一種全新的藥物發現策略。細胞內除了有能夠降解蛋白質的蛋白酶體外, 也有可降解RNA的核糖核酸酶, 與PROTAC類似, RIBOTAC技術慢慢發展起來。RIBOTAC局部招募內源性核糖核酸酶(recombinant ribonuclease L, RNase L)到特定結構化的目標RNA位點上, 組裝形成二聚體, 活化的RNase L選擇性降解RNA靶點。這為靶向RNA的小分子藥物提供了新的開發策略, 這種策略允許小分子藥物不必像傳統的RNA靶向藥物那樣必須結合到RNA的功能位點才能實現對靶標的抑制。
Disney課題組在研究中, 利用自己開發的基於序列的設計方法Inforna設計小分子, 以microRNA-21的3D摺疊結構為靶標, 從小分子文庫中進行確定了一個小分子25(圖7), 它選擇性地與miR-21 Disher位點結合, Kd值為20 µmol·L-1, 並抑制了體外核糖核酸內切酶Dicer酶加工。通過不斷優化, 最終確定了RIBOTAC小分子26。研究中發現, 該化合物特異性靶向致癌microRNA-21(pre-miR-21)的前體, 含有的雜環招募並激活核糖核酸酶(綠色), 以誘導前microRNA-21的酶解。隨後在小鼠模型中驗證了該化合物可以阻礙乳腺癌向肺的轉移, 轉錄組學和蛋白質組學分析也表明該化合物的有效性和選擇性, 可以特異性調節致癌途徑。實驗中發現, 核酸酶招募劑的功能是局部激活RNase L, 其GC值為0.84(GC為0表示非選擇性化合物, 而完全選擇性的GC為1.0), 表明其具有很強的選擇性。除此之外, 還通過實驗驗證了該化合物可以抑制miR-21所刺激的MDA-MB-231細胞侵襲現象的發生, 可以廣泛降低表達miR-21的黑色素瘤和肺癌細胞系的侵襲性。在ALS和FTD等進行性神經退行性疾病研究中, 為了開發更好的治療方法, Bush等研究發現了小分子27, 該小分子可以結合在RNA靶標上, 並在此基礎上表徵了一種具有雙重功能的小分子28, 不但可以選擇性地結合RNA的poly端中(GGGGCC)擴增片段, 還可以利用RIBOTAC技術招募RNase L(綠色部分)去除天然RNA的擴增。在患者源性脊髓神經元和ALS小鼠模型中, RIBOTAC分子成功誘導致病性mRNA降解並減少相關病理學特徵。該小分子在幾種患者衍生模型中治療了體外ALS/FTD的典型細胞, 並在小鼠模型中改善了ALS/FTD病理學特徵。使用該小分子去除病理性GC擴增可能是治療ALS/FTD的有效方法。
■ 近期以RNA為靶標的抗新型冠狀病毒(COVID-19)的小分子藥物研究
2019年末, 新冠肺炎暴發, 對國家的醫療保健系統、經濟和百姓日常生活造成了嚴重破壞。至今為止, 仍然處於一個嚴峻的情況, 對於新冠肺炎的治療刻不容緩。阿米洛利(amilorides, 29, 圖8)是一種已知的RNA結合配體, 該分子已證實可以作用於一系列的RNA二級結構。最近研究發現amilorides可以作為治療腸道病毒71型(enterovirus 71)先導化合物, 具體為: amilorides可以結合在該病毒RNA的5′-UTR區域, 干擾RNA與宿主蛋白的相互作用進而抑制病毒的複製。SARS-CoV-2同樣具有一個高度保守的5′末端, 該病毒的5′末端在病毒複製中非常關鍵, 能夠劫持宿主細胞的轉錄通路。新冠病毒RNA的5′-UTR及相鄰的SL6區域具有多種突起(bulges)和內環(internal loops)結構, 這些結構可以作為小分子藥物篩選的理想靶標, 同時也是amilorides的高效結合位點。Zafferani等以冠狀病毒OC43感染的Vero E6細胞為模型,測試前期合成的55個amiloride類似物的抗病毒活性, 發現了化合物30(DMA-132)、31(DMA-135)和32(DMA-155)可以顯著降低病毒滴度, 類似的測試也證實這3個化合物可以降低SARS-CoV-2的病毒滴度。螢光素酶檢測實驗證實病毒的5′-UTR和近端區域(proximal region)是小分子化合物發揮轉錄抑制作用的必需區域。DMA-155是抗新冠病毒活性最強的化合物, 作者通過NMR實驗進一步證實該化合物的作用位點位於5′末端的SL6區域。這項研究為靶向新冠病毒RNA的藥物開發開闢出一條新路徑。
SARS-CoV-2移碼RNA元件(frameshifting element, FSE)控制著pp1a和pp1ab兩種聚合蛋白(pp1a and pp1ab polyproteins)的轉錄, 而這兩種聚合蛋白是病毒複製及發病歷程中的關鍵蛋白, 因此FSE是新冠肺炎治療干預的良好靶點。有趣的是, 增強FSE熱穩定性可以損害移碼效率,尋找可結合FSE的配體是實現其穩定的可行策略。Haniff等通過兩種方法抑制SARS-CoV-2移碼, 一種是簡單的結合, 另一種是RIBOTAC技術。為了發現可靶向該區域的小分子, 作者從一個靶向RNA的包含3 271個化合物的分子庫進行篩選。經過幾輪的篩選確定了小分子33(C5)作為唯一的一個先導化合物, 研究發現C5可以選擇性地結合在FSE的UU內環(UU internal loop), Kd=11 nmol·L-1, 並且可以提高FSE的熱穩定性。獲得對SARS-CoV-2 RNA具有親和性的C5之後, 他們通過將C5連接靶向核糖核酸酶的調控子34, 設計出了C5-RIBOTAC。核糖核酸酶調控子可以與RNase L的單體結合, 並使兩個單體二聚化為活性的核酸酶。通過C5-RIBOTAC實現靶向切割和降解整個SARS-CoV-2 RNA的目的(圖9)。通過生物測定, 他們發現C5-RIBOTAC可以劑量依賴地降低SARS-CoV-2 RNA的水平, 並且證明了這種效應依賴於RNase L。
Zhao等用G-quadruplex預測軟體預測了SARS-CoV-2基因組中存在4個假定的G4序列(putative G4-forming sequences, PQSs)RG-1、RG-2、RG-3和RG-4(表 1), 這4個G4序列分別位於核衣殼蛋白(nucleocapsid protein)、非結構蛋白10(non-structural protein 10, Nsp10)及S蛋白(spike glycoprotein), 這幾個蛋白都是SARS-CoV-2的功能蛋白。隨後他們通過分別構建這4個G4序列, 經過螢光激活測定(fluorescence turn-on assay)、聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及NMR等實驗鑑定出只有RG-1可以形成穩定的G-quadruplex。並發現G-quadruplex的特異性配體PDP(35)可以增強RG-1的熱穩定性, 用凝膠電泳實驗證實了PDP與RG-1具有很強的親和力。隨後,他們發現RG-1 G-四鏈體能在細胞中形成, 也能在包含RG-1的核衣殼蛋白完整序列中形成, 在細胞中加入PDP可以劑量依賴地抑制核衣殼蛋白mRNA的轉錄, 並能降低核衣殼蛋白的表達量。SARS-CoV-2核衣殼蛋白通過與病毒基因組以及膜蛋白(M蛋白)的相互作用, 在病毒組裝過程中扮演重要角色。此外, 核衣殼蛋白對於病毒RNA轉錄和病毒複製的效率至關重要。鑑於核衣殼蛋白在病毒組裝及複製中的重要角色, G4s有望成為開發COVID-19治療藥物的新靶點, 為尋找有效的抗新冠病毒藥物提供了新思路。
總結
與大分子藥物相比, 小分子藥物具有許多優勢, 仍是一個具有前景的研發方向。在小分子藥物開發過程中, 接近99%的藥物的作用靶標是致病蛋白,但因近80%的蛋白質存在不可成藥的問題。在中心法則中, RNA處於蛋白質的上游, 許多疾病的發生也都存在著RNA的參與和介導, 靶向RNA的藥物開發越來越受到重視。以RNA為靶標的小分子藥物的研發還存在諸多的挑戰。受RNA自身結構性質的影響, 其作為靶標時往往面臨成藥性不好及特異性不足的問題。RNA靶標高度靈活, 存在多種構象, 現有技術對RNA結合腔的理解也遠不如蛋白, 以RNA為靶標的篩選分子庫如何建立仍缺乏方向。由於缺少系統性高通量的小分子篩選平台, 目前已有的可靶向RNA的藥物多為寡核苷酸[反義核酸、RNA干擾、微小核糖核酸(microRNA)]。內源性小分子有調控RNA功能的也不多, 這進一步限制了先導物的來源。基於以上原因, 靶向RNA的小分子藥物的研究一直停滯不前, 進展緩慢。同時, 已報導的靶向RNA的藥物大多處於臨床前階段, 在人體中的藥效也需在臨床試驗中進一步驗證。
儘管如此, 隨著一些靶向RNA的小分子藥物批准上市, 以及一些已知藥物被發現是通過與RNA結合而發揮作用, 為科學家研發以RNA為靶標的小分子藥物帶來了新希望。未來以RNA為靶標的小分子藥物開發中, 對RNA的結構進行更加深入的研究顯得尤為迫切, 建立更多的針對RNA靶標的化合物庫也很有必要。同時, 通過靶向RNA-蛋白複合體或者間接靶向RNA的小分子藥物, 如靶向RNA剪接體等, 也是以RNA為靶標的藥物開發的新策略。相信隨著越來越多的科研工作者投身於這一研究, 對小分子靶向RNA治療人類疾病方面的認識、理解和挖掘將會更加的深入, 也會有更多的靶向RNA的小分子藥物被發現。
原文：
1、杜曉利, 陳慧慧, 葉向陽, 謝恬, 何興瑞.以RNA為靶標的小分子藥物的研究進展[J].藥學學報,2022, 57(10): 2902-2913.
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