有多種蛋白水解酶可用於從粘附底物上脫離細胞，其中最常使用的是絲氨酸蛋白酶家族成員胰蛋白酶。 胰蛋白酶由胰腺外分泌細胞分泌的酶原—胰蛋白酶原產生，作用於賴氨酸或精氨酸的C末端側。其活性最適溫度為37℃，因此預熱胰蛋白酶可加速脫離。用高胰蛋白酶濃度長時間孵育，會剝離細胞表面蛋白並殺死細胞。更多內容請到默克生命科學官網查看：www.sigmaaldrich.cn
胰蛋白酶為許多細胞類型所耐受；然而，在蛋白質組學研究和無血清培養中需要避開胰蛋白酶。根據應用和細胞類型，可採用不同成分和濃度的胰蛋白酶。其部分性質如下。
-
EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）： 在存在鈣的情況下，粘附分子決定細胞-細胞以及細胞-基質間的相互作用。為了減弱這種相互作用，經常會在胰蛋白酶中添加EDTA，其螯合二價陽離子（Ca2+，Mg2+）。
-
酚紅：胰蛋白酶的最佳活性在7至9的pH範圍內實現（5466615）。在此範圍內的酚紅呈粉紅色。由於環境條件，胰蛋白酶的pH可能變為酸性，呈橙色並使胰蛋白酶的效果降低。通過用NaOH調節pH至7.4-7.6可以優化胰蛋白酶活性。
-
稀釋劑：將濃縮的胰蛋白酶溶解或稀釋在不含Ca2+或Mg2+的緩衝鹽溶液中，例如Hank平衡鹽溶液（產品編號：H9394），以維持pH和滲透平衡。此外，一些胰蛋白酶產品含有0.9％ NaCL作為稀釋劑，而不是Hank平衡鹽溶液。
-
來源和形式：胰蛋白酶的主要來源是豬，其以凍乾粉末形式或溶液形式提供。為了避免動物或微生物產品，重組牛胰蛋白酶也在玉米中表達，稱為Trypzean溶液（T3449）。
-
濃度：根據細胞類型和應用，胰蛋白酶以不同濃度使用。對於強附著細胞系，使用2.5％至0.25％（1X至10X倍稀釋）的胰蛋白酶。儘管有需要細胞表面蛋白質完整性的研究，但一般採用較低濃度（0.05％胰蛋白酶）溶液。
實驗方案
-
將胰蛋白酶溶液、平衡鹽溶液（不含Ca+2和Mg+2的溶液）以及生長培養基預熱至37 °C。
-
檢查細胞以確保細胞健康且無污染。
-
從培養瓶中取出並丟棄培養基
-
用不含Ca+2和Mg+2離子的平衡鹽溶液輕輕沖洗細胞，然後除去溶液。也可以用胰蛋白酶溶液洗滌牢固貼壁的細胞。然而，對於敏感細胞，首選平衡鹽溶液。
-
將適量（0.5 mL/10cm2）預熱後的胰蛋白酶溶液添加至培養瓶側壁。輕輕旋轉內容物以覆蓋細胞層。
-
將容器在室溫下孵育2-3分鐘。牢固貼壁的細胞可以在37 °C快速脫離。在顯微鏡下觀察細胞。脫離的細胞在顯微鏡下呈現圓形且有折射光。如果脫離的細胞少於90％，則將培養瓶再孵育2分鐘，並每隔30秒在顯微鏡下觀察一次細胞。
注意：防止細胞暴露於胰蛋白酶溶液時間過長（> = 10分鐘）。 -
細胞脫落後，加入2倍體積預熱的完全生長培養基以滅活胰蛋白酶。向細胞層表面輕輕移液培養基數次，以確保細胞回收率 > 95％。對於無血清培養物，以等摩爾濃度添加黃豆胰蛋白酶抑制劑（產品編號：T6414）以抑制胰蛋白酶。
注意：劇烈移液會導致細胞損傷。 -
將細胞懸液轉移至試管中，並以300-1000×g輕輕離心5-10分鐘。除去上清液，將細胞沉澱團輕輕重懸於預熱的完全生長培養基中。用血細胞計數器和台盼藍排除法或自動細胞計數器，去除所需樣品以確定活細胞的細胞密度。
-
將剩餘溶液稀釋至接種密度，並將適量體積吸移至培養瓶中，然後將其置於培養箱中。