上田原的敗北
根據《甲陽軍鑒》的記載，信濃國埴科郡葛尾城城主村上義清與志賀城的笠原清繁是同盟關係，因此當武田軍攻滅笠原清繁之後，村上家便與武田家斷交，雙方走向了對立。
天文十七年（1548年）二月一日，武田晴信率軍自甲府出陣，朝著葛尾城進軍，決定對村上家發起攻擊。然而，就在武田軍進軍途中，信濃國卻突然下起了大雪，導致武田軍的進軍受阻，士氣也遭受打擊。
得知武田軍來犯以後，村上義清也率軍自葛尾城出陣，與武田軍在上田原相遇。二月十四日，武田軍與村上軍展開相當慘烈的激戰，武田家重臣板垣信方、甘利虎泰、才間河內守、初鹿野傳右衛門尉等以下七百餘人戰死，武田晴信本人也在戰鬥中負傷。另外一方面，村上義清雖然只戰死三百餘人，要少於武田軍，但是即便是這樣的傷亡對村上軍的打擊也十分巨大，兩軍都喪失了繼續向對方挑戰的能力，但是又遲遲不肯撤軍，便一直在上田原對峙。
此時，留守甲府的駒井政武、今井信甫收到了武田軍敗北、武田晴信不願撤軍的消息，在商議之後，便請求武田晴信的母親大井夫人寫信勸說其撤軍。在母親的請求下，武田晴信最終同意了家臣們的請求，於三月二十六日撤軍回國。
值得一提的是，在上田原合戰中戰死的板垣信方、甘利虎泰是武田晴信統治前期的肱骨重臣，現今流行的通說中，將二人在武田家的地位稱呼為「兩職」。然而，實際上「兩職」的稱呼最早出現於文化十一年（1814年）編纂的關於甲斐國的百科全書《甲斐國志》之中，該書中提到「兩職」是由板垣、甘利兩家出任的職役，後來包括原虎胤、山縣昌景等人都有出任，是甲斐國內最高的職役。在山縣昌景出任兩職期間，他與原昌胤一同聯名下發文書，在山縣昌景戰死後，原昌胤便與長坂釣閒齋、跡部勝資一同署名。
可以看出，在《甲斐國志》中，「兩職」的地位其實就是武田家的筆頭家老。可是，當時板垣信方、甘利虎泰的地位，真的如同書中提到的那樣嗎？從兩家的名字中查勘，我們能夠發現板垣信方及其兒子板垣信憲受賜武田家的通字「信」字，而甘利虎泰、甘利昌忠父子只能受賜「虎」、「昌」等武田家的偏諱，兩家的家格其實還是有著相當的差距的。
武田晴信統治前期，板垣信方除了出任諏方郡郡司以外，其實還負責著武田家與今川家、本願寺等勢力的外交，是實打實的筆頭家老。在板垣信方戰死以後，武田晴信並未讓其兒子板垣信憲繼承父親的郡司職位，而是提拔了近臣長坂虎房（即長坂釣閒齋）為新任郡司。此後，板垣信憲在武田家內沒落，最終因為觸怒武田晴信遭到處刑，板垣家也因此衰弱。
與板垣家相比，甘利家的發展則大不相同。甘利虎泰、昌忠父子的地位雖然不如板垣家，但是武田晴信卻提升了甘利家的家格，將通字「信」字賜給了甘利昌忠，改名為「甘利信忠」。在父親甘利虎泰死後，甘利信忠在武田家內活躍於內政、外交等領域，武田晴信甚至將其提拔至筆頭家老的地位，取代了板垣氏的地位。
遺憾的是，甘利信忠三十四歲時就英年早逝，去世時兒子甘利信賴年僅八歲，自然無法出任筆頭家老。正是因此，在武田晴信統治後期的武田家中，武田晴信提拔了近臣山縣昌景，成為新一代的筆頭家老。也就是說，武田家其實並不像山內上杉家等家族那樣有著代代世襲筆頭家老的家族，而是靠武田晴信根據家臣能力進行任免的。另外，像原虎胤這樣的連武田家譜代家臣都算不上的外來人口，不可能會出任筆頭家老這樣的職務。而《甲斐國志》記載中在山縣昌景死後與跡部勝資、長坂釣閒齋聯名簽署政令的原昌胤，在歷史上於長筱合戰中與山縣昌景一同戰死了，更加不可能會死而復生簽署政令。因此，《甲斐國志》中所謂板垣、甘利出任「兩職」之說，其實是子虛烏有的事情。
實際上，《甲斐國志》中的「兩職」，很可能是來源於《甲陽軍鑒》中記載的職役「職」。在當時的室町幕府內部，對幕臣中的大家族有著「三管四職」的稱呼，其中出任侍所所司，負責維持京都治安的家族便被稱為「四職」。《甲陽軍鑒》中記載的武田家的「職」，其實同「四職」的職能是一樣的，僅僅是負責在武田領國內施行武田家的警察權而已，並非是筆頭家老的地位。這樣一來，原虎胤這樣的足輕大將出任「職」便也不是什麼奇怪的事情了。
小笠原長時的敗亡
上田原合戰之後，信濃國的小縣郡、佐久郡便出現了反抗武田家統治的叛亂，這些國人叛亂的背後支持者，便是在上田原合戰中取得勝利的村上義清。此後，小縣郡、佐久郡的許多國人都加入了村上家的一方，武田家的勢力衰退至佐久郡的內山城。
面對信濃國的危機，武田晴信並未慌亂，他先是任命板垣信方的弟弟室住虎登前往上原城出任上原城代，而後又與諏方大社下社的金刺氏聯絡，命其穩定住諏方郡的治安。此外，武田晴信還將不久前臣服的高遠賴繼召喚到了甲府，防止其在伊那郡作亂，又派近臣山本菅助前往高遠城，防禦可能來襲的敵軍，還給佐久郡、諏方郡的國人們安堵領地的文書，穩定他們的人心。
另外一方面，村上義清團結了山內上杉家、府中小笠原家以及先前被迫從屬武田家的大井貞清、藤澤賴親等人，對諏方郡、伊那郡發起了攻擊。好在在山本菅助的抵抗下，來犯高遠城的敵軍很快就被擊退了。
天文十七年（1548年）四月二十五日，村上義清率軍對佐久郡的內山城發起攻擊，於城下縱火後撤退。六月十日，府中小笠原長時、安雲郡國人仁科道外對諏方大社下社發起攻擊。七月十一日，諏方西方眾響應村上家、府中小笠原家的號召起兵作亂，小笠原長時隨即出兵鹽尻峠，與諏方西方眾一同在上諏方四處燒殺。
面對敵軍的大舉進犯，武田晴信終於忍無可忍了。此時信濃國的武田軍除了在上原城籠城外，並無餘力平定叛亂，因此武田晴信便在收到諏方西方眾叛亂的同日，率軍自甲府出陣，抵達了甲信的國境。七月十八日，武田晴信率軍進入了上原城，又在同一天的夜裡，偷偷率軍出城，來到了小笠原軍布陣的鹽尻峠的山麓下。由於信濃國時不時都有前來參陣的反武田勢力，小笠原長時自恃兵力強盛，並未注意到武田晴信的動向。次日清晨，武田軍突然對鹽尻峠的小笠原軍發起奇襲，本就是由烏合之眾組成的小笠原軍瞬間陣腳大亂，戰死千餘人後全軍總崩。武田晴信一路追擊至信濃國築摩郡的村井，在同地修築了村井城作為攻擊府中小笠原家的前沿陣地後，便在七月二十五日撤軍返回了上原城。
八月，武田晴信任命長坂虎房為新任諏方郡郡司前往上原城，並將諏方西方眾的領地全部沒收，收為武田家的直轄領。此後，武田家開始對佐久郡叛亂的國人發起攻擊。九月，田口城、前山城等城池被武田家收復，大井貞清也在不久之後被武田軍俘虜，送往了甲府幽禁。
天文十八年（1549年）八月，武田家在今川義元的中介下與村上義清和談，但是兩家卻因為領地原因遲遲沒有進展。在此期間，小縣郡原本從屬於村上家的和田城城主大井信定加入了武田家的一方，村上家的勢力在小縣郡大為衰退。而佐久郡一邊，除了小諸城、岩尾城以外，大部分領地都被武田家給收復了。經過武田晴信的反擊，武田家逐漸在對村上家、府中小笠原家的戰爭中占了上風。
天文十九年（1550年）四月，安雲郡的國人仁科道外暗中投靠了武田家。七月三日，武田晴信率軍出陣，越過鹽尻峠後進入了前線陣地村井城之中。十五日，武田軍對築摩郡的府中小笠原家麾下諸城發起猛攻，在府中小笠原家的「伊奴伊城」被武田軍攻陷之後，府中小笠原家的根據地林城、深志城、岡田城、桐原城、山家城等幾座城池相繼陷落。與此同時，府中小笠原家也出現了響應武田家號召的叛亂，小笠原長時不得不拋棄領地逃亡，前往葛尾城依附村上義清。占領了築摩郡以後，武田晴信下令廢掉府中小笠原家的根據地林城，大肆改修深志城作為武田家在築摩郡的據點，並派遣重臣馬場信春、日向是吉進入深志城。
砥石崩
天文十九年（1550年）八月，由於村上義清與高梨政賴在北信濃交戰，趁著這個機會，武田晴信開始對村上家的領地發起攻擊。
擋在武田軍前進路線上的，是信濃國小縣郡的砥石城。砥石城是通往川中島地區的松代街道、通往善光寺的保科街道等交通的交匯點，也是村上義清根據地葛尾城的屏障，一旦控制了此地，武田家便進可攻北信川中島地區，退可守小縣郡。而如果村上義清失去砥石城的話，村上家的領地就將直接暴露在武田軍的威脅之下。
八月二十四日，武田晴信派遣家臣率領先遣部隊前往砥石城探路。二十八日，武田晴信親率大軍抵達砥石城附近的屋降著陣。二十九日，武田軍抵達砥石城下，包圍了砥石城。此外，武田晴信還積極地調略村上義清方的國人，眼見武田軍來勢洶洶，清野氏、寺尾氏等國人紛紛背離了村上家，宣布從屬武田家。九月九日，武田軍對砥石城發起攻擊，由於砥石城的地點十分重要，村上家對此地也十分重視，早就修築好了深溝高牆，因此守軍依靠堅固的工事頑強抵抗。十九日，經過十天的攻擊，砥石城依舊屹立不倒，好在川中島方面的須田氏等豪強在這期間前來投誠，因此武田晴信倒也沒有十分在意。
眼見砥石城危在旦夕，村上義清不得不改變自己的策略，急忙與老對手高梨政賴議和。不僅如此，村上義清還說服了高梨政賴，前幾日還在對峙的兩家如今結成同盟，組成聯軍一同抵抗武田家的入侵。九月二十三日，村上義清、高梨政賴包圍了寺尾城，武田晴信急忙派遣真田幸綱、今井信甫率軍前往救援。二十八日，村上·高梨聯軍擔心被武田軍包抄後路，撤去了對寺尾城的包圍，真田幸綱等人也在解除了寺尾城的危機之後，回到了砥石城下的陣中。
武田軍對砥石城的攻擊已經持續了一個月了，卻遲遲沒有取得戰果。此時村上義清已經與高梨政賴結成同盟，砥石城下的武田軍變得有些危險了起來，因此武田晴信決定另擇時機，暫時放棄攻打砥石城。十月一日，武田軍撤除包圍開始後撤，得知武田軍撤退的村上義清率軍追擊，與武田軍的殿後部隊發生激戰。下午六時左右，武田軍擊退了村上軍，但是武田家重臣橫田高松，郡內國人小澤式部、渡邊出雲守等一千餘人戰死。
這場合戰被後世稱為「砥石崩」，這是武田晴信繼承家督以來除了上田原合戰之外的第二場大敗，也是武田晴信一生之中唯一的一次指揮失誤導致殿軍損失慘重。據說許多武田軍的士兵一路上丟盔棄甲，連武器都丟棄了狼狽地逃回了甲斐國。在信濃國方面，四處都流傳著村上義清殺死了五千餘武田軍的謠言，極大地振奮了信濃國的反武田勢力的士氣。幸而武田晴信率領的大軍因為殿後部隊的血戰並未損失多少，於十月二日返回了諏方郡上原城。七日，武田晴信率軍返回了甲斐國。
擊敗武田軍的村上義清本想乘勝追擊，一路殺進了佐久郡。然而此時佐久郡的國人們已經被武田軍給打出了心理陰影，並沒有多少人響應村上義清起兵。十月二十一日，府中小笠原長時在村上義清的支持下殺回了築摩郡，進入了平瀨城之中，許多府中小笠原家的舊臣們也紛紛起兵響應。深志城的馬場信春、日向是吉得知此事後，一面收集糧草準備籠城，一面向甲斐派去使者求援。
十月二十三日，武田晴信率軍自甲府出陣，剛經歷大敗的武田晴信並不想直接與村上·小笠原聯軍產生正面衝突，便派出間諜在信濃國四處散播武田軍準備攻打葛尾城的謠言。村上義清得知武田晴信出陣並準備攻打葛尾城以後，不顧小笠原長時的勸說，急忙率領著村上軍返回了領地。小笠原長時返回築摩郡靠的本就是村上義清的援軍，因此在村上軍撤走以後，小笠原家的舊臣們失去了對抗武田軍的信心，紛紛四下逃散，小笠原長時也只得放棄平瀨城逃亡，前往中塔城籠城。
真田幸綱的出身
天文二十年（1551年）五月二十六日，令所有人都沒有想到的是，武田家家臣「信濃先方眾」之一的真田幸綱，憑藉著自己的力量奪取了砥石城。
根據江戶時代創作的真田家系圖來看，真田家自稱是清和天皇的後裔滋野氏出身，以海野為苗字。到了戰國時代時，海野棟綱的嫡孫幸隆（幸綱）因為居住在信濃國小縣郡的真田鄉，因此才改以「真田」為苗字。然而，信濃國豪強滋野氏的出身疑點非常之多，例如真田家主張滋野氏的始祖是清和天皇之子貞秀親王，貞秀親王的長子幸恆自稱「海野小太郎」，到了幸恆之子時，他的三個兒子分別繼承與開創了海野氏、禰津氏、望月氏三個家族，被稱為「滋野三家」。可是，文化九年（1812年）江戶幕府編纂《寬政重修諸家譜》時，真田家獻上了自家的系圖，但是幕府卻認為無法確認貞秀親王這個人在歷史上是否存在，因而在系圖中貞秀親王的邊上標註了「尚待考證」，這說明幕府官方其實也並不認可滋野氏的天皇后裔出身。
實際上，在真田幸綱的弟弟矢澤賴綱的菩提寺之中也有一份真田家的系圖存留，上面提到矢澤賴綱是真田右馬佐賴昌的第三子。也就是說，真田家並不是真田幸綱開創的，而是在戰國時代之前就已經存在的豪族。值得注意的是，根據《信州滋野氏三家系圖》的記載，源賴朝時期的御家人海野幸氏有個孫子叫「真田七郎幸春」。因此，這個人很可能就是真田家的先祖，而真田家也並非是海野家的嫡流，而是鎌倉幕府時代就出現的海野氏分出的一支庶流而已。
戰國時代的真田氏中興之主，就是我們非常熟悉的真田幸隆。不過，真田幸隆這個名字是在編纂《寬永諸家系圖傳》時才在真田家的系圖之中出現的，在同時代的史料中並沒有出現過「真田幸隆」這個名字。真田幸隆的生母「玉窗貞音大禪尼」的供養塔位於高野山的蓮華定院，而根據蓮華定院的供養帳記錄，真田幸隆在高野山留下的名字是「真田彈正忠幸綱」。另外，在永祿五年（1562年）六月十三日真田家奉納給山家神社的板扉（門）上，也有記載奉納人為「大檀那幸綱並信綱」，也就是真田幸綱與真田信綱父子。因此，通說中的真田幸隆，在戰國時代使用的名字其實是「真田幸綱」。
根據近年來的考證，真田幸綱雖然不是海野棟綱的嫡孫，但是他的父親真田賴昌卻娶了海野棟綱之女，所以真田幸綱實際上是海野棟綱的外孫。不過，根據高野山供養帳的記錄推測，海野棟綱與真田賴昌的年紀有可能相仿，因而日本學者丸島和洋認為，娶了海野棟綱女兒的可能並非是真田賴昌，而是真田幸綱本人。
值得一提的是，真田幸綱的弟弟矢澤賴綱是真田賴昌的三子，但是真田賴昌的次子難以在真田家系圖中尋覓蹤跡。而在永祿十年（1567年）信濃國國人向武田信玄效忠時繳納給武田家的誓書之中，我們可以發現當時繼承海野家的武田信玄次子海野龍芳下屬的國人之中，有一個叫做「真田右馬助綱吉」的傢伙也在武田家的麾下。「右馬助」即是「右馬佐」，也就是真田賴昌的官職，從官職繼承來看，真田綱吉才有可能是真田賴昌的繼承人，因此才會繼承父親的官職。可是從名字來看，真田綱吉、矢澤賴綱繼承的名字之中都只拜領了宗家海野棟綱的偏諱「綱」字，只有真田幸綱拜領的是海野家的通字「幸」字，說明當時真田幸綱雖然不是嫡系，但是因為他是海野棟綱的女婿（或外孫），因此地位要比兄長、弟弟都要高，這才被立為真田家的繼承人。
奪取砥石城
根據《甲陽軍鑒》的記載，天文十六年（1547年）武田晴信攻打志賀城的「碓氷峠合戰（志賀城合戰）」時，真田幸綱便已經出現在了武田軍的參陣者名單之中。不過真田幸綱真正臣屬武田家的具體時期卻無法考證，因此該記載僅能提供參考。另外在同書的記載中，真田幸綱臣屬武田家時，武田晴信將其舊領真田鄉賞賜給他。然而此時的真田鄉實際上在村上義清的控制之下，武田晴信自然是難以慷他人之慨，將別人的領地賜給真田幸綱。
天文十九年（1550年）七月二日，武田晴信下發朱印狀，允諾真田幸綱的請求，將諏方形、上條等位於真田鄉附近共一千貫的領地賜給真田家。這些領地同樣在村上義清的統治之下，因此真田幸綱此舉其實是希望能夠作為武田家的前鋒從村上義清處奪回舊領，而考慮到真田家在當地的影響，武田晴信便答應了他的請求。之後武田晴信便趁著村上義清與高梨政賴對峙時出兵信濃國攻打砥石城，並在撤軍時發生了「砥石城」這場大敗。
在「砥石崩」以後，真田幸綱返回舊領的希望似乎又再一次落空。好在此時的武田家經過武田信虎、晴信父子兩代的經營，並非像村上家、府中小笠原家那樣是一個鬆散的聯盟性質的政權，而是一個相對團結、凝聚力也十分強勁的戰國大名。另外，「砥石崩」時武田家的本陣大軍並未遭受多少損失，因此真田幸綱靠著武田家的威懾，尚且還能留在信濃國。
天文二十年（1551年）五月二十六日，砥石城這座武田軍久攻不下的城池，竟然被真田幸綱以謀略調略，不戰而降。真田幸綱是如何奪取砥石城的，從良質史料上無法尋到記載，駒井政武在日記《高白齋記》中也僅僅只簡單地提到了一句「真田奪取了砥石城」，並沒有記載詳細的過程。
而在《甲陽軍鑒》等軍記物中，則對真田幸綱奪取砥石城的經過有著相當詳細的記載。根據軍記物的記載，真田幸綱先是派遣了海野眾之一的春原若狹、春原惣左衛門兄弟前往村上義清處詐降，謊稱自己將與村上家裡應外合奪取真田幸綱所在的城池，希望屆時村上義清能夠派出軍隊協助。村上義清不知是計，從麾下抽調了五百人前去接管城池，村上軍雖然在春原兄弟的帶領下順利地進入了真田幸綱駐守城池的正門及三之丸，但是在抵達二之丸時，城門突然關閉，三之丸與本丸里冒出了許多真田家的伏兵，形成關門打狗之勢，困在二之丸的村上軍殲滅。砥石城內的許多守軍本就是當地的滋野一黨出身，在海野平合戰後被迫臣服於村上家，如今同族真田幸綱殲滅了村上軍並趁勢來襲，砥石城內真田一族出身的矢澤賴綱便趁機打開城門，砥石城就這樣兵不血刃地落入了武田家的手中。七月，由於砥石城的陷落，被切斷與村上家聯繫的小諸城大井高政、岩尾城大井彈正也紛紛投降。
進入十月以後，村上義清再次與小笠原長時組成聯軍侵入了安雲郡，攻陷了丹生子城。得知村上義清再度來襲後，武田晴信率軍出陣，於十月二十日進入築摩郡深志城，並在二十四日攻陷了平瀨城。在任命原虎胤為平瀨城守將後，武田晴信與馬場信春、日向是吉等率軍繼續朝著安雲郡進軍。
天文二十一年（1552年）八月，武田晴信奪取了安雲郡小岩岳城。此後，水內郡小川城城主大日方氏來降，武田家的勢力進一步向北邊擴張。在這樣的情況下，小笠原長時只得棄城逃亡，前往依附北信國人高梨政賴、越後國大名長尾景虎等等。小笠原長時於天文二十三年（1554年）回到信濃國伊那郡依附鈴岡小笠原信定（小笠原長時的弟弟）。在武田家對下伊那發起侵攻以後，小笠原長時、信定兄弟難以抵抗，只能再度出逃，途徑伊勢國上洛，前往京都依附當時京畿的霸主三好長慶去了。
天文二十二年（1553年）三月，武田晴信繼續在築摩郡、安雲郡攻打府中小笠原家的舊臣及村上義清方的國人。四月二日，苅屋原城陷落，此後塔原海野氏、會田海野氏、青柳氏、麻績氏等國人紛紛臣服武田家。另外一方面，更級郡的屋代城、荒砥城城主屋代氏、鹽崎城城主鹽崎氏、牧野島城城主香坂氏、小縣郡室賀城城主室賀氏等原本從屬村上家的國人也紛紛投降，村上家根據地葛尾城周邊幾乎布滿了從屬武田家的國人。
在這樣的情況下，村上義清擔心被武田家給困死在葛尾城中，只得帶著一族與重臣棄城逃亡。在村上義清的請求之下，越後國的長尾景虎與村上義清、高梨政賴等北信國人將組成聯軍，成為武田晴信一生以來最強大的敵人。