聚丙烯醯胺凝膠通過丙烯醯胺與雙丙烯醯胺（N,N』-亞甲基雙丙烯醯胺）的反應形成，產生高度交聯的凝膠基質。凝膠充當篩子，蛋白質在電場作用下通過這個篩子。蛋白質總體帶正電或負電，這使得蛋白質分子能夠朝向等電點移動，在等電點分子沒有淨電荷。通過使蛋白質變性並賦予它們均勻的負電荷，可以在它們向正電極遷移時基於它們的大小分離它們。更多內容請到默克生命科學官網查看：www.sigmaaldrich.cn
圖 1.蛋白質樣品和色同步蛋白標記物的SDS-PAGE（C1992）
實驗方案
所需材料和試劑
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包含電源、玻璃板、墊片和點樣梳的垂直電泳室
注意：丙烯醯胺和雙丙烯醯胺在性質上具有神經毒性。所有步驟均應佩戴無粉手套進行。
製備凝膠
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用去離子水和乙醇清潔凝膠澆注裝置的玻璃板和墊片。
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將玻璃板和墊片組裝在穩定、平整的表面上。
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根據所需凝膠的百分比，使用以下體積製備分離凝膠溶液（製成體積為10 mL）。
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將凝膠溶液倒入組裝了墊片的玻璃板中。為了使分離凝膠表面保持均勻和水平，用水或異丙醇（I9516）間隔表面。
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讓凝膠在室溫下凝固約20-30分鐘。
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使用以下體積製備積層凝膠溶液（製成體積為10 mL）：
樣品製備
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在一定體積的蛋白質樣品（細胞或組織裂解液）中，加入等體積的上樣緩衝液。
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將上述混合物在95°C下煮沸5分鐘，16000G離心5分鐘。
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這些樣品可以在-20°C下儲存，也可以用於進行凝膠電泳。
凝膠染色
考馬斯藍染色：用考馬斯亮藍R-250染色蛋白質凝膠是顯示通過SDS-PAGE分離的蛋白質的常用方法。它非常靈敏，適合長期儲存凝膠。
所需試劑
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凝膠固定液 (500 mL)
甲醇 (M3641) 250 mL
冰醋酸 (695092) 50 mL
水 200 mL
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考馬斯溶液
CBB R-250 (B6529) 0.1%
甲醇 (M3641) 40%
冰醋酸 (695092) 10%
使用Whatmann 1號濾紙過濾染色溶液。
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脫色溶液
甲醇 (M3641) 50 mL
冰醋酸 (#695092) 35 mL
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凝膠儲存溶液
冰醋酸 (695092) 25 mL
水 475 mL
操作流程
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電泳後，將凝膠放入含有凝膠固定溶液的塑料托盤中。將托盤放在搖床上固定蛋白質2小時。
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丟棄凝膠固定溶液，然後加入考馬斯溶液。 放在搖床上，將凝膠染色2-4小時。
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染色步驟後，用蒸餾水洗滌凝膠數次，以去除多餘的染料。
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將脫色溶液添加到凝膠。放在搖床上脫色約4個小時，直到可以看到清晰背景上的清晰藍色條紋。
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脫色後，可將凝膠儲存在凝膠儲存溶液中，並根據需要拍照。
銀染
我們提供適用於SDS-PAGE凝膠的高靈敏度蛋白質檢測銀染試劑盒。還需要以下試劑：
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固定溶液
乙醇 (E7023) 50 mL
醋酸 10 mL
水 40 mL
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30% 乙醇（E7023）溶液
操作流程
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電泳後，將凝膠浸入固定溶液40分鐘。在固定溶液中浸泡過夜能產生更清晰的背景。
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丟棄固定溶液，用30％乙醇溶液洗滌凝膠10分鐘，然後用超純水洗滌10分鐘。
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倒出水，並將凝膠在敏化劑溶液中孵育10分鐘。
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丟棄敏化劑溶液，用水洗滌凝膠兩次，每次洗滌持續10分鐘。
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倒出水，並將凝膠浸泡在銀溶液中10分鐘。
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倒掉銀溶液，並在水中洗滌凝膠1.5分鐘。
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倒掉水，將凝膠浸入顯影液中3至7分鐘。
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向顯影液中加入5 mL終止液，孵育5分鐘。丟棄顯影液/終止液，在超純水中洗滌凝膠15分鐘。
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這時凝膠可以拍照，也可以儲存在新鮮的超純水中。
雙重染色：使用CBB R-250對凝膠進行染色，然後使用上述步驟進行銀染色。
螢光染色：我們為蛋白質電泳提供螢光SYPRO和Lucy染色劑。可以在黑暗中將凝膠浸入螢光染色劑中，或者在電泳過程中將凝膠與陰極緩衝液混合。
可逆凝膠染色
可逆凝膠染色使用戶能夠在SDS-PAGE後進行蛋白質的西方蛋白印跡。
R-PROB染色：R-PROB是一種獨特的染色劑，可用來檢測PAGE凝膠和西方蛋白質印跡上的蛋白質。
所需試劑：
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用於膜和聚丙烯醯胺凝膠的可逆蛋白質檢測試劑盒（RPROB）
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固定溶液（F7264）
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10% 醋酸
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EDTA 50 mM
操作流程
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將電泳後的凝膠浸入固定溶液中20分鐘。重複此步驟兩次。
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在水中沖洗凝膠兩次，每次沖洗持續30分鐘。
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將凝膠在染色溶液中孵育20-40分鐘，同時輕輕攪拌。
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用10％醋酸洗去多餘的染色劑。
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脫色：用EDTA洗滌凝膠，然後在水中或固定溶液中洗滌15分鐘，洗兩次。
銅染色：為了確認蛋白質的遷移和分離，凝膠可以用可逆染色劑（如CuCl2）染色。
所需試劑
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0.3 M CuCl2溶液
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0.25 M Tris和0.25 M EDTA溶液
操作流程
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將電泳後的凝膠用蒸餾水沖洗最多30分鐘。
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將凝膠浸入0.3 M CuCl2溶液中10分鐘。
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用去離子水沖洗。
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蛋白質可以在藍色背景上顯示為清晰的區域。
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脫色：反覆在0.25 M Tris和0.25 M EDTA溶液（pH 9）中洗滌染色的凝膠。
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在進行後續的轉印操作之前，將脫色後的凝膠轉移至轉印緩衝液中。
圖 2.印跡和垂直電泳系統