在解釋 qPCR 的工作原理之前，我們想簡要概述一下它與標準 PCR 和 RT-PCR 的區別。
標準 PCR 在反應完成後監測 DNA 擴增，而 qPCR 使用螢光信號在反應進行時監測 DNA 擴增。 這就是為什麼 qPCR 也稱為實時 PCR、定量 PCR 或定量實時 PCR。
RT-PCR，不要與實時 PCR 混淆，代表逆轉錄 PCR，可用於擴增 RNA 目標序列。 它涉及在擴增前將樣品 RNA 與逆轉錄酶和 DNA 引物進行初始孵育。
qPCR 的工作原理
qPCR 依靠來自嵌入染料或水解探針的螢光來測量每個熱循環後的 DNA 擴增。 最常見的基於染料的方法是 SYBR Green，最常見的基於探針的方法是 TaqMan。
SYBR Green qPCR
與標準 PCR 一樣，SYBR Green 方案由變性、退火和延伸階段組成。 不同之處在於，您在 qPCR 設置期間將一些雙鏈 DNA 結合染料 SYBR Green I 添加到預混液中。 這種螢光染料在延伸階段嵌入到雙鏈 DNA 序列中，顯示出螢光信號的強烈增加。 在每個熱循環結束時測量此信號將使您能夠確定存在的雙鏈 DNA 的數量。
SYBR Green 檢測的缺點是染料會與任何雙鏈 DNA 序列結合。 這意味著您還可以檢測非特異性 qPCR 產物（例如引物二聚體）發出的螢光。 為消除這種風險，通過執行熔解曲線分析檢查反應特異性，或使用 TaqMan 方法。
TaqMan qPCR
該測定不使用嵌入染料，而是使用帶有 5' 螢光報告染料和 3' 淬滅染料的 TaqMan 探針。 這些探針是目標特異性的，並且在退火步驟中僅與引物之一下游的目標 DNA 序列結合。 當 Taq 聚合酶在延伸階段遇到 TaqMan 探針時，它會置換並切割 5' 報告染料。 一旦報告染料與淬滅染料分離，其在每個 qPCR 循環結束時的可測量螢光信號就會顯著增加。 第二條 DNA 鏈是平行合成的，但由於沒有探針附著在它上面，因此無法通過螢光測量來監測這一過程。
與 SYBR Green 檢測相比，使用 TaqMan 探針的成本更高，但也具有兩個顯著優勢：
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TaqMan 檢測僅測量目標序列的擴增進程，因為探針是目標特異性的。
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您可以通過向主混合物中添加不同的引物和具有不同報告染料的 TaqMan 探針來監測單個反應中各種 qPCR 產物的數量。 這種多重方法允許您在每個熱循環結束時檢測多個螢光信號。
圖1.SYBR Green 與 TaqMan原理示意圖
對於這兩種 qPCR 方法，數據在擴增圖中可視化，x 軸為熱循環數，y 軸為檢測到的螢光信號：
圖2. qPCR 擴增數據圖