微生物細胞工廠能以經濟、綠色環保的形式將廉價底物轉換為高價值產品，如精細化學品、生物能源、天然產物、生物藥物等。有毒或易揮發中間代謝物的泄漏，降低了微生物細胞工廠的轉化效率。將代謝路徑關鍵酶定位於天然細胞器可以提供有利的化學環境並封存有毒化合物。由於天然細胞器的滲透性和數量有限，仍然難以進一步提高化學品合成效率。
近期，江南大學生物工程學院劉立明教授團隊，以無膜細胞器為研究對象，基於蛋白組裝構建了一種材料屬性可調的無膜細胞器，用於輔助微生物細胞工廠生產化學品。該研究成果「Engineered Artificial Membraneless Organelles inSaccharomyces cerevisiaeTo Enhance Chemical Production」正式發表於Angewandte Chemie International Edition(IF = 16.823)（https://doi.org/10.1002/anie.202215778）。
作者篩選了形成無膜細胞器的無序蛋白結構域，評估了A-IDPs在液滴飽和度、溫度穩定性和細胞生長方面具有的優勢，最後在釀酒酵母中構建了穩定且高效的無膜細胞器。
為了改變蛋白液滴大小，作者構建了一系列不同長度的A-IDPs結構域(0.5 A-IDPs、1.0 A-IDPs、1.5 A-IDPs、2.0 A-IDPs)並將其在釀酒酵母中進行表達，發現：(1)隨著A-IDPs結構域長度的增加，形成蛋白液滴的細胞比例從19.9%(0.5 A-IDPs)增加到89.7%(2.0 A-IDPs); (2)液滴平均直徑從0.36 μm (0.5 A-IDPs)提高到2.6 μm (2.0 A-IDPs)。
為了改變蛋白液滴的剛性，將朊病毒結構域(sPFD)融合到A-IDPs，形成重組sPFD-A-IDPs，並在體外對比分析了sPFD、A-IDPs和sPFD-A-IDPs形成的蛋白液滴螢光漂白恢復(FRAP)程度，發現sPFD和sPFD-A-IDPs螢光恢復程度比A-IDPs分別下降了44.9%和40.1%。接下來，將sPFD-GFP、A-IDPs-GFP和sPFD-A-IDPs-GFP融合蛋白表達於釀酒酵母中並形成蛋白液滴，將蛋白液滴與10%的1,6-己二醇一起孵育，發現A-IDPs-GFP迅速溶解，而sPFD-GFP和sPFD-A-IDPs-GFP的液滴僅僅溶解了0.6%和8.8%。
為了使細胞根據需要調整液滴的大小和剛性，構建液滴性質調節開關(CPRS)，主要由蛋白組裝模塊和藍光激活模塊組成。其工作原理是融合有蛋白互作標籤的客戶蛋白在藍光響應啟動子的控制下啟動表達，然後在高親和力二聚化標籤（P3-P4）作用下，客戶蛋白被強制定位到液滴支架（P3-A-IDPs-mKate）中，從而達到調整液滴性質的目的。
作者在利用酵母細胞同化甲醇的過程中發現，穩定期細胞中約有21.7%的細胞死亡率，其原因是RuMP路徑的中間代謝物甲醛積累量達到68.3 μM，導致了細胞毒性。為了進一步提高甲醇的同化能力，減少甲醛毒性對細胞的傷害，作者通過調控釀酒酵母工程菌株ZP03-FM（包含甲醇同化路徑和蘋果酸合成路徑）中甲醇同化無膜細胞器的尺寸，降低甲醛的泄露，使得甲醇消耗量和蘋果酸產量分別提高了162%和61%。
乙醯輔酶a是多種重要化合物的代謝前體，通常通過丙酮酸脫羧產生，因此不可避免的會造成碳損失。為了避免乙醯輔酶a合成過程中的碳損失，過表達來源雙岐桿菌的磷酸酮醇酶（xfspk）和來源克氏梭菌的磷酸轉乙醯化酶(Pta)，構建了非氧化糖酵解路徑。在此此基礎上，敲除6-磷酸果糖激酶（PFK1/2）和磷酸水解酶（GPP1），使碳通量由氧化糖酵解轉向非氧化糖酵解，形成了一條可以減少碳損失且增加乙醯輔酶a供應的代謝路徑。然而，該工程菌株的生長速率降低了43.6%，其原因可能是非氧化糖酵解不能為細胞生長提供足夠的能量。為解除這一限制，作者在釀酒酵母工程菌株ZP04-RB中調節了糖酵解無膜細胞器的剛性。在生產階段，使乙醯輔酶a的合成從氧化性糖酵解切換為非氧化性糖酵解，最終使二氧化碳的釋放量減少了35%，正丁醇的產率增加了20%。
該工作在全面了解無膜細胞器形成機制的基礎上，設計高效合理的調控工具來調節無膜細胞器的物理特性，使無膜細胞器應用於化學品的合成，為設計高性能工業菌株提供了一種新的策略。
劉立明教授為論文的通訊作者，江南大學生物工程學院2018級博士生周配為第一作者。上述研究得到了國家自然科學基金重點項目(22038005)、國家重點研發計劃項目(2020YFA0908500)、江蘇省前沿引領技術基礎研究專項項目(BK20212013)的資助。
近年來，劉立明課題組致力於解析生物加工過程中生物體(微生物/酶)的生理特性和調控機制，發展強化生產性能的新技術和新方法，以創建新一代工業菌株和性能先進的酶製劑，提升生物製造過程的效能，實現生物技術產品的低成本製造。在Nat Catal、Nat Commun、Chem Rev、Metab Eng、Green Chem、微生物學報、生物工程學報等國內外生物工程類主流學術期刊上發表學術論文260餘篇，授權發明專利70餘項、出版科技著作4部。
來源:江南大學新聞網
編輯:張俊傑