劉博談 | 核酸擴增方法盤點

大家好，我是劉博，在之前的文章當中，我給大家介紹了核酸檢測的物理和化學原理和檢測方法，今天我們就來談一談核酸擴增技術。

為了滿足對更靈敏核酸檢測的需求和取代放射性同位素標記探針的願望，核酸擴增技術被引入了，我們可以先對核酸進行擴增，然後進行檢測。在過去，我們需要使用放射性同位素核酸探針來達到檢測的最大靈敏度。但隨著核酸擴增技術的出現，現在，我們只需要將目標DNA從一個拷貝擴增到數百萬個拷貝就能增加核酸的靈敏度。再加上更靈敏的非輻射檢測系統（如化學發光探針）的引入，終於，我們可以不需要放射性同位素探針，也能進行具有相同靈敏度的核酸檢測了。

核酸擴增是隨著PCR技術的發展和具有專利的熱穩定DNA聚合酶的使用而開始的[1, 2]。在引入PCR之後，人們對核酸擴增系統進行了大量的研究。我們可以將這些研究分為三種擴增類型：目標、探針和信號。任何超靈敏測試的關鍵問題都是如何避免攜帶污染。所有的擴增技術都需要密封研究方案來有效的控制污染。我們也可以在PCR擴增過程中使用修飾過的鹼基（即脫氧尿苷5′三磷酸[dUTP]），然後在隨後的擴增之前將其銷毀，從而消除之前擴增反應的任何交叉污染，具體方法見目標擴增方法一節。

目標擴增

所有的目標擴增方法都依賴於寡核苷酸（即引物或探針）與目標核酸（DNA或RNA）的最初特定鹼基配對。這些方法的主要區別在於擴增方案，反應中使用的酶的類型和數量，以及是否需要溫度循環。擴增過程的總反應時間在不同的方法之間也有很大差異。

聚合酶鏈式反應

PCR技術使用熱穩定的DNA聚合酶來合成由特定引物在兩端定義的目標DNA區域（見圖1）[1, 2]。引物對由短的寡核苷酸（15至30個鹼基）組成，選擇自目標物的已知核酸序列，對應互補DNA（cDNA）鏈。從理論上講，該反應能夠從一個起始拷貝產生數百萬個目標DNA拷貝。反應是通過一系列的溫度變化來完成的，包括三個步驟：

• 變性（DNA鏈在高溫下分離）；
• 退火（引物在較低但仍然嚴格的溫度下與互補鏈相連）；
• 延伸（在中等溫度下從引物開始的5′到3′DNA鏈的合成）。

圖1 | PCR[3]

一個DNA序列（模板）在含有寡核苷酸引物、熱穩定DNA聚合酶、脫氧核苷酸和鎂離子的緩衝反應液中被擴增。反應液被放入熱循環儀，熱循環儀對反應成分進行加熱和冷卻，使其暴露在各種溫度的連續循環中。在每個溫度循環中，發生三個步驟：變性、引物退火和引物延伸。積累的產品的理論數量如下。N（總） = N（初始）2^X，其中 「X」是循環次數。實際積累的產品數量如下。N（總）=N（初始）（1+Y）^X，其中「Y」是每個周期的效率。可以用多種方法檢測擴增子，包括凝膠電泳、用特定探針印跡/雜交、捕獲/檢測探針，或用放射性、螢光或酶標直接標記引物或探針。

縮略語：DNA，脫氧核糖核酸；PCR，聚合酶鏈反應。

對於某些反應，退火和延伸步驟也可以合併為一個步驟。這兩到三個步驟定義了一個周期。理論上，每個周期都有一個目標序列的翻倍（即2^n，其中n=周期數）。通常情況下，要進行25到40個周期，然後用上述規格之一進行產品檢測（見《劉博談：核酸檢測方法盤點》一文）。在通過逆轉錄酶PCR初步合成cDNA鏈或使用多功能酶，如從嗜熱菌中分離出的DNA聚合酶之後，RNA（如腸道病毒）也可作為目標。

基於轉錄的擴增系統

轉錄擴增系統（TAS）是一種體外RNA轉錄系統，使用逆轉錄產生cDNA（即通過逆轉錄酶）和RNA轉錄（即通過RNA聚合酶）產生RNA[4]。引物一端包含DNA依賴性RNA聚合酶的啟動子序列，另一端包含特定的目標序列。因此，目標擴增是由每個cDNA模板產生許多RNA分子的結果。TAS的缺點是在適度的熱循環溫度下進行（如37℃和42℃），這可能導致非特異性雜交和特異性降低。轉錄介導的擴增和NASBA（見圖2）是TAS的例子，已被應用於傳染病菌的診斷。

圖2 | 基於轉錄的擴增系統（NASBA和TMA）[3]

NASBA和TMA是類似的等溫反應，使用RNA目標作為反轉錄酶的底物，由RNA模板產生cDNA鏈。由此產生的RNA：DNA雜交體中的RNA被RNase H降解，cDNA被用作RNA聚合酶的模板，這樣就產生了多個cDNA的RNA拷貝。結果可以是定性的或定量的。

縮略語：cDNA，互補DNA；DNA，脫氧核糖核酸；NASBA，基於核酸序列的擴增；RNA，核糖核酸；RNase H，核糖核酸酶H；RT，逆轉錄酶；TMA，轉錄介導的擴增。

鏈式置換擴增

鏈式置換擴增（SDA）[5, 6]是一種等溫的體外DNA擴增技術，其基礎是限制性酶能在其識別位點的半磷酸鹽形式的未修飾鏈上產生缺口，而DNA聚合酶能在缺口處啟動複製並置換下游的非模板鏈（見圖3）。

圖3 | SDA[3]

SDA是一種等溫擴增技術，其中包含目標特異性區域和半修飾限制性酶位點的引物與DNA聚合酶結合，生成含有限制性酶位點的合成dsDNA。一種限制性酶在dsDNA的兩條鏈中的一條上產生一個特定位點的「缺口」。一旦鏈被缺口，DNA聚合酶就會在缺口部位的3′端開始合成，創造出一條新的DNA鏈。由於所使用的DNA聚合酶缺乏5′到3′的外切酶活性，它在聚合新鏈時不會破壞現有的鏈；它只是取代了下游的非模板鏈。然後，每條被移位的鏈都可以與更多的引物退火，這個過程繼續進行，新形成的DNA鏈被反覆挑斷、延伸和移位。整個過程導致原始DNA目標的指數式擴增。

縮略語：DNA，脫氧核糖核酸；dsDNA，雙鏈DNA；SDA，鏈式位移擴增。

含有核酸限制酶識別位點的SDA引物在待擴增序列的側翼位置與先前熱變性的目標DNA的相反鏈結合，並被延長。含有限制性酶識別位點的擴增模板鏈（目標片段），通過與SDA引物結合位點上游結合的緩衝引物的延伸，從起始目標中移出。目標片段在等溫條件下通過有義和反義反應的耦合進行指數擴增，其中從有義反應中移出的鏈作為反義反應的目標，反之亦然。

環路介導擴增

環狀介導擴增（LAMP）是一種等溫方法，它依賴於Bst DNA聚合酶和一組四到六條引物的自動循環鏈位移DNA合成[7]。兩個內引物和兩個外引物定義了目標序列，另外還增加了一組環形引物以提高反應的靈敏度。LAMP反應的最終產物是DNA分子，具有由目標序列重複組成的多環的菜花狀結構（見圖4）。通過監測反應管中因DNA擴增過程中產生焦磷酸鎂沉澱而產生的濁度，可以實時分析產品。在瓊脂糖凝膠中，經過電泳和溴化乙錠或dsDNA插層染料的染色，擴增產物也可以被觀察到。

圖4 | LAMP[8]

（a）LAMP反應的引物設計。為了便於解釋，在目標DNA上指定了六個不同的區域，從5′端開始分別標為F3、F2、F1、B1c、B2c和B3。由於c代表互補序列，所以F1c序列與F1序列是互補的。在LAMP方法中使用兩個內引物（FIP和BIP）和外引物（F3和B3）。FIP（BIP）是一個由F1c（B1c）序列和F2（B2）序列組成的混合引物。（b）起始結構產生步驟。從FIP開始的DNA合成過程如下。F2區與目標DNA上的F2c區退火併啟動延伸。DNA擴增以類似的方式與BIP進行。F3引物與目標DNA上的F3c區域退火，並發生鏈式置換的DNA合成。從FIP拉長的DNA鏈被替換並釋放。被釋放的單鏈在其3′端形成一個環狀結構（結構3）。以單鏈DNA為模板，以BIP和B3為引物，以與前面所述相同的方式進行DNA合成，生成兩端具有環狀結構（啞鈴狀結構）的結構5。（c）循環擴增步驟。以自體結構為模板，自體DNA合成從3′端F1區開始，延伸從FIP退火到環狀結構中F2c區的單鏈開始。通過幾個步驟，產生了結構7，它與結構5互補，結構5由結構8產生，其反應與由結構5-7產生的反應相似。結構9和10分別由結構6和8產生，同時還產生了更多的細長結構（11, 12）。

縮略語：DNA，脫氧核糖核酸；LAMP，循環介導的擴增。

LAMP已經成功地用於一些LDT，以檢測DNA和RNA病毒以及診斷黴菌感染。因為LAMP是一個等溫的過程，陽性反應可以通過簡單的濁度測量來檢測，或者直接用肉眼觀察，所以不需要昂貴的設備。這些屬性使其成為資源有限環境和現場使用的一項有吸引力的技術。然而，LAMP的引物設計比PCR更複雜，因為需要專門的培訓和軟體。

螺旋酶依賴擴增

螺旋酶依賴擴增（HDA）是一個等溫過程，利用螺旋酶分離dsDNA並產生單鏈模板，用於引物雜交和隨後由DNA聚合酶延伸[9]。由於螺旋酶以酶的方式解開dsDNA，PCR所需的初始熱變性和隨後的熱循環步驟都可以省略。在HDA中，dsDNA的鏈被DNA螺旋酶和ssDNA包被的ssDNA結合蛋白分開。兩個序列特異性引物與目標序列的每個邊界雜交，DNA聚合酶延長與目標序列退火的引物，產生dsDNA。這兩個新合成的產物在下一輪擴增中被螺旋酶用作底物。因此，同時進行的鏈式反應導致所選目標序列的指數式擴增（見圖5）。

圖5 | HAD[10]

HDA使用兩個序列特異性引物在待擴增片段的側翼和一個用於DNA鏈分離和聚合的混合酶擴增目標序列。在HDA反應的第一步，螺旋酶加載到模板上並沿著目標DNA穿越，破壞了連接兩條鏈的氫鍵。螺旋酶對單鏈目標區域的暴露使引物退火。然後DNA聚合酶利用游離的脫氧核苷酸延長每個引物的3′末端，產生兩個DNA複製。兩個複製的DNA獨立地進入HDA的下一個周期，導致目標序列的指數式擴增。

縮略語：DNA，脫氧核糖核酸；HDA，依賴螺旋酶的擴增。

HDA與多種檢測技術兼容，包括定性和定量的螢光技術以及為實時PCR設計的儀器。此外，HDA已顯示出開發簡單、便攜的DNA診斷設備的潛力，可在現場或醫療點使用。

核酸內切酶擴增反應

尼氏內切酶擴增反應（NEAR）結合了一種等溫核酸擴增技術，提供DNA或RNA擴增，與基於螢光的探針檢測一起使用時，可在10分鐘內得到結果[11]。兩個模板，每個模板包含一個目標、一個連接酶識別位點和三種酶：一個熱穩定DNA聚合酶、一個逆轉錄酶和一個熱穩定連接內切酶，為RNA目標的指數放大提供基礎或NEAR（見圖6）。

圖6 | NEAR機制

（A） NEAR擴增雙鏈的形成機制。（1a和2a）T2的識別區與互補的目標區結合，並由聚合酶沿目標區延伸。（3a）第二個T2與同一目標結合併被延長，取代第一個T2。（4a） T1的識別區與釋放鏈中的補體結合，並延伸到5′端，形成一個雙鏈拈花酶識別點。（5a）粘著酶結合併粘著（用剪刀表示）。（6a）聚合酶沿著T1合成斷裂的3′OH，置換出剩餘的目標補體，最後延伸出的雙鏈複合物被稱為NEAR擴增雙鏈。（B）產品的形成機制。（1b和2b）粘連酶與NEAR雙鏈上的兩個粘連酶識別位點結合；兩個位點的裂解和SDA形成兩個複合物，每個複合物由一個雙鏈穩定區、一個粘連酶識別區和一個單鏈目標組成。（3b和4b）反覆的連接、聚合和鏈式位移導致產物1和2的擴增。被裂解的複合物被再生（3b），而產物1和2可以分別退火到T1和T2（4b），導致雙向延伸並產生雙鏈，在裂解時產生相反的產物。這些產品繼續循環，直到模板、脫氧核苷三磷酸酯或酶被耗盡。

縮略語：NEAR，核酸內切酶擴增反應；SDA，鏈式位移擴增。

探針擴增

連接酶擴增反應

連接酶擴增反應（LAR）（見圖7）使用熱穩定的DNA連接酶將目標的每條DNA鏈上的兩個緊密間隔的寡核苷酸探針連接起來（即共四個探針）[12]。與PCR類似，該反應使用溫度循環來變性和退火。與PCR不同的是，LAR用結紮代替延伸形成產物，儘管最近的測試形式要求聚合酶活性在結紮前填補雜交探針之間的小間隙，減少非特異性目標獨立結紮事件。然後，該產品作為後續反應的目標。可使用生物素化引物來簡化和加快檢測過程。

圖7 | LAR[3]

DNA模板被變性，隨後與探針組雜交，這些探針組被設計為在目標鏈上彼此相鄰雜交。雜交的探針被DNA連接酶連接（連接），形成一個連接產物，它模擬了原始目標序列的一條鏈，可以作為連接更多探針的模板。在這個圖中，反映了一種市售的LAR方法，在探針組與靶標雜交後，會有一個小的間隙，通常是1到3個核苷酸，防止在沒有特定靶標的情況下結紮。在用DNA連接酶連接之前，用DNA聚合酶和脫氧核苷酸來延長探針並填補空白區域。當標記的鏈子被結合在微粒子上的抗體分子捕獲時，就會被檢測到。酶標記的抗體被結合併催化酶促反應以產生一個信號。

縮略語：DNA，脫氧核糖核酸；LAR，連接酶擴增反應。

瓣膜內切酶-1 DNA聚合酶為基礎的擴增

通過DNA聚合酶的瓣膜內切酶-1家族成員對特定DNA結構的識別和裂解，可以進行等溫探針擴增（見圖8）。裂解反應要求探針只在其3′域與感興趣的目標核酸互補。第二個「入侵者」探針緊靠第一個探針的上游結合，要求至少有一個核苷酸的重疊，以形成附錄中圖A8所示的結構。裂解後釋放出下游探針的5′結構域，隨後作為二級入侵者探針。二級入侵者寡核苷酸可以啟動對螢光探針的裂解，從而產生螢光信號。

圖8 | 基於FEN-1 DNA聚合酶的擴增

一個信號探針和一個在其3′域與感興趣的目標互補的第二探針與目標序列雜交。一個嗜熱結構特異性的5′內切酶能識別結合的探針的單bp重疊構型。酶在重疊的位置裂解信號探針的一個臂，從而使原來的目標序列可以再次與更多的探針結合。然後通過熱循環過程，裂解的探針積累並被檢測到，因為它們與捕獲寡核苷酸（FRET探針）雜交，其中加入了螢光報告染料和猝滅劑分子。探針裂解後，螢光報告染料與猝滅劑分子分離，使可測量的螢光信號在暴露於外部光源時積累。

縮略語：bp，鹼基對；C，胞嘧啶；DNA，脫氧核糖核酸；F，螢光團；FEN-1，瓣膜內切酶-1；FRET，螢光共振能量轉移；G，鳥嘌呤；Q，猝滅劑。

循環探針

循環探針技術是另一種形式的等溫探針擴增，它依賴於RNA與cDNA目標雜交時被RNase H的特異性水解[13, 14]。探針可以由純RNA寡核苷酸組成，也可以是DNA-RNA-DNA混合寡核苷酸，內部只有三到四個核糖核苷酸殘基。裂解產物的解離允許隨後結合和裂解另一個探針，啟動一個裂解循環。使用標記的循環探針可以對反應進行連續的實時（同質動力學）監測。

信號放大

基於獨特的溶液相夾心雜交檢測，再加上信號放大，可以測試到樣品中的RNA或DNA。對於支鏈DNA（bDNA）測試（見圖9），多個特定的合成寡核苷酸與目標雜交，將其捕獲到微孔板的表面。

圖9 | bDNA信號放大[3]

DNA或RNA從目標生物中釋放出來，發生多個探針的雜交。目標核酸被結合在固體表面的多個捕獲探針捕獲。成套的延伸探針與目標核酸和信號擴增多聚體（bDNA）都有雜交。酶標記的探針與bDNA結合，並通過化學發光過程進行檢測，其中光的發射量與目標的原始數量成正比。

縮略語：bDNA，支鏈DNA；DNA，脫氧核糖核酸；RNA，核糖核酸。

合成的bDNA放大器分子和多份鹼性磷酸酶連接的探針被雜交到固定化的複合物上。檢測是通過將複合物與化學發光底物孵化並測量光的發射來實現的。由於目標物沒有被放大，信號與目標物核酸的水平近似成正比。樣品中特定目標物的數量由標準曲線確定[15]。

混合捕獲技術（見圖10）是基於使用對DNA：RNA雜交分子具有特異性的抗體。這些試劑既可用於純化也可用於感興趣的核酸的末端檢測。DNA鑑定測定使用RNA探針，它與變性的DNA目標雜交，而RNA測試則使用DNA探針來創造混合雜交物種。檢測抗體是酶連接的，允許使用化學發光試劑進行靈敏的末端檢測。

圖10 | 混合捕獲[3]

單鏈RNA或DNA探針分別被添加到變性的目標DNA或RNA上。形成DNA：RNA雜交體，並用對雜交體有特異性的抗體捕捉到一個固體支架上。每個雜交種還可以結合多份特定的抗體，這些抗體與一種酶偶聯。捕獲的雜交種可以用化學發光法進行檢測。

縮略語：DNA，脫氧核糖核酸，RNA，核糖核酸。

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