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核酸檢測（nucleic acid tests, NATs）能夠從微量的遺傳物質中獲得大量的分子信息，因此在疾病診斷和監測領域具有不可或缺的地位。其中，藉助於大量的樣本操作和昂貴儀器的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）是目前集中式臨床實驗室主要的核酸檢測方法。然而針對目前個體化醫療的發展，在患者床邊或即時檢測（point-of-care testing, POCT）逐漸成為發展趨勢。同時，在廣泛傳播的感染可造成嚴重發病率甚至死亡的中、低收入國家，開發可現場診斷的標準NATs對於監測和管理病毒、細菌以及寄生蟲感染來說至關重要。因此將PCR等NATs小型化為可便攜、低成本的檢測平台是目前疾病診斷、監測領域的熱點研究之一。對於可攜式NATs本身而言，比色信號是一種理想的信號輸出方式，但是目前開發簡便、可定量且通用的顏色讀出器依舊有很高的需要。故而，開發成本低廉、設計簡單的用戶友好型定量比色檢測平台對於即時診斷以及資源有限地區疾病診斷至關重要。
近期，四川大學李峰（點擊查看介紹）課題組與吳鵬（點擊查看介紹）課題組合作，報導了一種使用DNA嵌入染料（DNA intercalating dyes, DIDs）進行比色核酸檢測和定量的方法，作者將之命名為FLASH（Fast Light-Activated Substrate cHromogenic，快速光激活底物顯色技術，圖1）。DIDs是核酸染色和定量PCR（qPCR）等標準NATs的通用染料，現有的測試主要利用其嵌入DNA後的螢光增強特性。該團隊之前的研究發現：染料嵌入DNA後也能產生單線態氧（1O2，圖2a）[1]，從而使傳統的螢光DIDs轉換成type-II型光敏劑。利用這一原理，FLASH技術可快速光氧化顯色底物，產生比色信號讀出。而且通過與PCR集成，成功將基於DID參與的螢光PCR轉化為比色PCR。為了更適用於POC以及現場診斷，他們繼續開發了兩種讀出平台：可攜式FLASH設備和紙基FLISH測試條，展現出FLISH PCR良好的臨床應用潛力（圖1）。
圖1. 使用FLISH系統可視化、比色檢測和/或定量不同生物和臨床樣本中遺傳生物標誌物的工作流程。就診斷檢測流程而言，首先通過PCR或等溫擴增提取DNA或RNA，繼而利用FLISA系統檢測。通過溶液顏色由無色變為藍色來進行相應靶標核酸的檢測。最後，可通過手持式電子FLISA信號讀出裝置或紙基FLISA測試條在point-of-care場所定量檢測。
圖2. 方法原理和優化。a. FLASH反應中光敏過程的機理示意圖。b. 基於光催化檢測PCR擴增子的信噪比篩選14種DNA嵌入染料。其中，比色信號通過分析模擬PCR擴增子的10 nM dsDNA得到，背景則是通過分析模擬引物的10 nM ssDNA獲得。c. 篩選常用的顯色底物來優化ELISA系統的顯色讀出。d. 分別使用FLISA（藍色）、dsDNA螢光定量試劑盒（紅色）以及A260（綠色）檢測Lambda DNA標準物的滴定曲線。
首先，為了使PCR的可視化、比色讀出成為可能，作者期望在不降低分析性能的情況下將螢光DIDs轉換成顯色系統。為此，他們篩選了10種DIDs以及6種常用顯色底物，對比方法信背比確定最佳組合：以SYBR Green I (SG-I) 為光敏劑（圖2b），以3,3,5,5 -四甲基聯苯胺（TMB）為顯色底物（圖2c）。在此條件基礎上，進一步對比了該方法與傳統基於螢光turn-on方法的檢測能力，如圖2d所示，其檢出限可與螢光檢測法相媲美（LOD：FLISH 2 pg/μL vs 螢光法 1 pg/μL），表明在未損失分析性能前提下FLASH有潛力取代螢光進行PCR的顏色讀出。
進一步，作者將其作為信號讀出系統與PCR結合，開發比色FLASH-PCR。以B肝病毒（HBV-S）為目標，選擇與之表面蛋白基因序列相對應的184 bps的合成DNA模板作為檢測的靶標基因。通過系統優化FLASH-PCR的操作條件，包括光源設計、引物濃度、SG-I濃度、TMB濃度，以及PCR擴增子與FLASH試劑的預孵育時間。研究發現：FLASH-PCR的魯棒性較好，在不同檢測條件下性能都很穩健，且不需預孵育即可產生相應顏色變化。另外光碟機動的顏色開發高效且易於控制，5 s的光照時間足以產生滿足核酸定量的比色信號，僅需打開或關閉光源LED即可啟動或終止顏色變化（圖3b）。正如預期，FLASH-PCR的動態範圍取決於PCR的循環次數（圖3b），1 aM HBV-S模板（每個反應約10個拷貝數）在35個循環後可達到與qPCR相當的方法檢出限。最後，進一步將FLASH系統相繼與逆轉錄酶PCR、菌落PCR以及直接PCR相結合，證實其還適用於細胞、細菌和血清樣本。
圖3. FLISH PCR。a. 使用FLISH PCR分析臨床或生物樣本的工作流程示意圖；b. 分別在不同光照時間（上圖，35個循環）以及PCR循環數（下圖，5s光照）條件下對拷貝數由6.0 – 6.0×106的合成DNA標準物進行FLISH PCR檢測。
在對FLASH-PCR進行方法驗證和優化之後，下一步面臨的挑戰是如何將實驗轉移至更能代表實際檢測的條件下。為此，作者選擇了具有代表性的一類臨床疾病作為現場檢測評估對象。土源性線蟲（soil transmitted helminth, STH）感染是一類影響超過15億人的全球健康問題，也是導致兒童營養不良和認知障礙的重要原因之一。然而經典的顯微方法在臨床診斷STH時靈敏度、特異性不夠，而基於qPCR的NAT方法太過昂貴，無法在普遍貧困和資源缺乏的疾病流行性地區實施檢測。因此他們的目標是將FLASH-PCR作為一種便攜的qPCR替代方法進行STH感染的現場診斷和管理。
為了實現方法現場檢測，PCR擴增以及FLISH技術都需要使用可攜式平台。由於智慧型手機控制的可攜式熱循環儀已經商品化，所以作者專注於開發一種可攜式電子信號讀出裝置（可攜式FLASH快速顯色設備），為PCR擴增子提供穩健、可靠的檢測。自細節而言，FLASH信號讀出裝置集成了光照模塊（一個高強度LED，λ = 490 nm）和顏色傳感模塊（圖4a & 4b）通過在兩模塊間切換可實現現場原位檢測光碟機動顏色變化。通過3D列印將所有模塊封裝，並利用Arduino控制器以及開原始碼進行操作。
作者選擇β-微管蛋白上密碼子200的基因片段（經過廣泛驗證的針對TT鑑別和耐藥試驗的基因標誌物）相對應的164bp合成DNA標準物來評價所開發的可攜式儀器FLASH-PCR的分析性能。利用智慧型手機控制的可攜式熱循環儀（miniPCRTM mini8）成功擴增不同濃度的合成DNA標準物，接著利用FLASH信號讀出裝置進行檢測（圖4c，頂部），基於此建立的標準曲線（1 min光照）與q-PCR靈敏度類似（圖4c），證實該裝置可成功進行定量檢測，且性能可與商品化q-PCR相媲美。最後，為了驗證該裝置的現場檢測能力，他們在兒童患病率超過50%的宏都拉斯農村地區選擇適量接受過驅蟲藥治療的學齡兒童，現場採集含有鞭蟲（Trichuirs, TT）以及人蛔蟲（Ascaris lumbrioides, AL）的寄生蟲樣本並提取基因組DNA，後轉移至加拿大進行FLASH-PCR分析。利用該信號讀出裝置所得結果與顯微鏡檢測定性以及PAGE凝膠分析結果非常一致（圖4d），顯示出他們的技術以及裝置在現場疾病診斷、檢測領域的應用潛力。
圖4. 可攜式FLISH信號讀出裝置檢測STH感染。a. FLISH信號讀出裝置的完整組裝圖示（左）與關鍵單元圖示（右）。b. FLISH信號讀出裝置工作原理示意圖。c. 使用一定濃度梯度的DNA標準物產生的PCR擴增子進行FLISH信號讀出裝置性能評估。其定量能力與商品化的qPCR性能相當（下圖）。d. 分析由宏都拉斯農村地區經化療後的學齡兒童排出的鞭蟲和人蛔蟲等寄生蠕蟲樣本來評估FLISA信號讀出裝置的現場診斷價值。
為了進一步降低FLASH-PCR對儀器的需求，他們最終開發出使用距離作為信號讀出方式的紙基FLASH測試條。該測試條採用蠟染工藝製作，利用疏水屏障創建清晰的圓形加樣區和線性測試區（圖S13）。之前的研究發現：SG-I會緊緊保留在加樣區，只有在dsDNA存在下才能被洗脫到測試區 [2]。故而，在顏色顯影測試區沉積一薄層TMB，可以將螢光轉換為永久性的藍色來作為距離讀出依據（圖5a）。因此，微量的核酸樣本可以經過直接PCR擴增後，再利用FLASH測試條以無讀出裝置的方式進行檢測(圖5b)。圖5c和5d為利用FLISH PCR直接分析未經稀釋的人血清樣本的HBV基因片段。其中，圖5c中拷貝數為6.0 × 102的HBV基因片段（dM = 21 mm）在紫外燈下的遷移距離，可與空白樣本明顯區分（dM= 3 mm）。之後在光碟機動下顏色變化1 min，測試區顯影為藍色，因此通過測試條的遷移距離可直觀地讀出檢測結果（圖5d）。
圖5. 紙基FLISH測試條基於距離的核酸定量。a. FLISH測試條上的距離顯影原理。b. 分析未經稀釋的人血清樣本中HBV基因片段的工作流程。c. 紫外燈下測量6.0×102拷貝數的HBV基因片段和空白樣的距離。d. 將基於螢光的距離讀出轉換為通過光照和FLISH反應的比色讀出。
綜上所述，李峰課題組與吳鵬課題組成功開發出一種新型比色FLASH PCR平台，有助於將PCR的靈活性拓展至POCT以及現場診斷領域。僅需要將PCR擴增子與SG-I和TMB兩種化合物直接混合，再進行光照即可完成FLASH反應。通過組裝可攜式電子信號讀出裝置（FLASH reader）以及紙基FLASH測試條，並採用不同的PCR方法，成功證實了FLASH-PCR的簡易性和靈活性。因此他們認為，FLASH技術將很容易被用於在分散環境下進行快速、穩健且靈敏的核酸檢測，從而為即時診斷以及資源有限地區疾病診斷產生真正實用的幫助。儘管目前僅利用FLASH進行PCR的終點檢測，但他們相信未來實現實時FLASH PCR是完全有可能的。為了實現這一目標，他們正分別在分子和設備兩方面進行努力，包括篩選更適用於實時PCR的FLISH反應物和條件，以及為FLASH裝置配備加熱模塊等。
該研究成果於近期發表於Analytical Chemistry 雜誌。四川大學李峰教授與吳鵬教授為該論文共同通訊作者，李峰課題組董天彧為本文第一作者。
Colorimetric Polymerase Chain Reaction Enabled by a Fast Light-Activated Substrate Chromogenic Detection Platform
Tianyu Dong, Hayam Mansour, Hao Hu, Guan A. Wang, Colton J. F. Watson, Michael Yousef, Gabriela Matamoros, Ana L. Sanchez, Adam J. MacNeil, Peng Wu*, Feng Li*
Anal. Chem., 2020, 92, 6456–6461, DOI: 10.1021/acs.analchem.9b05591
【參考文獻】
1. Zhang, X.; Huang, C.; Xu, S.; Chen, J.; Zeng, Y.; Wu, P.; Hou, X., Photocatalytic oxidation of TMB with the double stranded DNA–SYBR Green I complex for label-free and universal colorimetric bioassay. Chem. Commun., 2015, 51, 14465-14468.
2. Wang, G.; Dong, T.; Mansour, H.; Matamoros, G.; Sanchez, A. L.; Li F., Paper-Based DNA Reader for Visualized Quantification of Soil-Transmitted Helminth Infections. ACS Sens., 2018, 3, 205-210.
導師介紹
李峰
https://www.x-mol.com/groups/li_feng_scu
吳鵬
https://www.x-mol.com/groups/wupeng_scu
本文作者：高露（gaolulucky@163.com）