朝倉、淺井同盟成立
在信長越過復興幕府的形式、明確建立霸權的目標後，不願被其吞併的勢力也浮現出來。其中之一就是越前的朝倉義景。信長於元龜元年（1570）四月出兵越前，試圖攻陷敦賀郡的城寨，以翻越木芽嶺，但位於江北的淺井長政卻突然舉兵，對信長形成夾擊。信長令木下秀吉固守金崎城（今福井縣敦賀市）殿後，這樣才好不容易從湖西逃回了京都。
趁此機會，江南各地爆發叛亂，六角父子及其舊臣與伊賀、甲賀的武士等人聯合起來對抗信長大軍。為此，信長於六月十九日率軍攻打淺井的主城小谷城。德川家康也作為同盟軍前來助戰。織田軍包圍淺井的支城衡山城後，不出信長所料，淺井、朝倉軍南下救援，由此展開了著名的姊川合戰。六月二十八日凌晨，淺井、朝倉軍向南推進，在姊川之前分成兩軍布陣。德川家康軍從西邊攻打朝倉軍，信長軍從東邊攻打淺井軍。雙方你進我退，陷入混戰，最終信長取勝。信長寫信給細川藤孝說自己「大獲全勝」，「敵屍遍布田野」，並在文末讓他告訴義昭，顯然是為了向義昭施壓。
雖然在姊川合戰中敗下陣來，但淺井和朝倉成立的反信長同盟鼓舞了對信長勢力極速擴張而深感不安和不滿的人。逃到阿波伺機反攻的三好三人眾馬上開始行動，揮軍進入攝津，據守大坂本願寺西部野田及福島（今大阪市）各城。《言繼卿記》記載說有七八千人，其中很多是浪人。同一時期，筒井順慶開始在大和攻打松永久秀。信長於八月二十日從岐阜出發，義昭也隨之親征。九月初，信長收縮包圍網，實行炮擊，展開了激烈攻勢。
本願寺起義
大坂本願寺處於信長的包圍網中，僧正顯如擔心一旦野田和福島城被攻陷，下一個就會輪到自己。九月六日，他對近江中郡的門徒說：「此刻應效仿開山祖，毫不退讓，奮不顧身，以示忠誠」，鼓動叛亂。奈良興福寺大乘院住持尋憲也在九月六日的日記中記載了這樣的傳聞：「世人皆說，上自大坂，下至諸國，群情激奮，一揆蜂起。」九月十日，顯如回信同意了淺井長政的結盟邀請，決心守護宗門。十二日深夜，一向一揆開始攻擊河川對面信長的營寨，英勇作戰。顯如向諸國僧侶及門徒發去檄文，要求他們奮起反抗並給予援助。由此，以大坂為中心的本願寺、一向一揆與信長的長期抗爭就拉開了帷幕。長達十一年、一直持續到天正八年（1580）的本願寺-織田戰爭（大坂合戰，即所謂石山戰爭）開始了。
十三日傍晚，一揆蜂起的消息傳到京都。十五日，天皇決定派敕使去見將軍，並開始敲定人選。在天皇給本願寺僧正（顯如）的敕書中有如下文字：
如今大樹（將軍義昭）為天下太平出征，信長亦如斯。聽聞貴僧慫恿一揆，與他們敵對，不應行此不妥之事。望早日化解干戈，貴僧的想法大可上奏。
社會地位處於交戰雙方之上的人，認為義昭和信長是為天下和平而戰，而本願寺、一揆與其敵對。這種邏輯，信長自是求之不得。況且，這種邏輯還不是信長強加於天皇的。對信長來說，這正是天皇存在的價值。
為呼應本願寺暴動，朝倉和淺井軍也開始行動。他們擺出進攻京都的架勢，信長只好放棄攻打野田和福島城，撤回軍隊。事實上，如果朝倉和淺井軍真的南下形成夾擊，再加上一揆的游擊戰，信長軍就有遭受重創的危險。信長率軍經京都進入近江，以償還自己分國中的山門領地為誘餌，要求比叡山協助。他還威脅說，如果出家人不願意支持任何一方，那至少不能幫助敵人；不然他就要一把火燒掉整座山。但是比叡山沒有理會信長的要求。朝倉軍在比叡山及其周圍布下了陣。
火燒比叡山
元龜二年（1571）八月，信長出兵江北，與一揆勢力交戰，然後進軍江南，攻擊一揆盤踞的金森寺。金森寺陷落後，九月十二日，信長斷然下令火燒比叡山。
《信長公記》記載了信長軍從山麓攻上山頂，沿路燒毀各種建築的情形：
以根本中堂、三王廿一社為首，各種貢品、佛寺、靈社、僧房、經卷全被燒毀，如雲霞飄散，灰燼遍地，甚為可悲。
該書還記載了殘忍的殺戮行為：
僧俗、兒童、智者、上人被一一斬首，上呈至信長公面前。無論是延曆寺內的高僧、貴僧、有智之僧，還是美女、兒童，皆被抓捕，列於御前，惡僧之輩不在話下，即便他們哀求饒命，也終不得饒恕，被一一斬首，其景慘不忍睹。數千具屍體遍布其地，實為悲哀之結局。
《言繼卿記》則記載說殺了「僧俗男女三四千人」。信長在十三日上洛，向義昭炫耀戰果。言繼雖然深受刺激，但也馬上去向信長請安。他在十二日的日記中寫下「佛法破滅」「王法何在」等語，表現出不安和搖擺不定的心情。對他們來說，王法（天皇、將軍施政的政治）和佛法（佛教教義和佛教）正如車的兩個輪子。他們認為佛法興隆也能使政治安定，所以佛法的象徵——比叡山被無情地燒毀，這件事給他們帶來了多麼巨大的衝擊和恐懼，常人難以想像。正因如此，他們才不得不去向信長行禮，以求保身。天皇家也不例外，《御湯殿上日記》中的十二日條對火燒比叡山一事評論道：「近日之事無以言表，可笑竟說是為了天下，簡直難以下筆。」
火燒比叡山是對依靠朝廷和政治盡享榮華富貴的舊勢力的鎮壓，給人留下佛法破滅的強烈印象。一直以來，人們以此事為代表，將信長評價為否定舊勢力、開創近世新政治和新社會的革命家。這種看法雖然有一定的道理，但若對此做不加保留的讚賞卻很危險。信長近臣所著《信長公記》記載說，比叡山在前一年違背信長的意願支持淺井和朝倉，燒山是為了泄憤，結果「一年來的積鬱終得發泄」。也就是說，燒山的本質仍是針對敵對者的攻擊行為。另外，之所以進行毫不留情的攻擊，是因為反感、憎惡僧侶們「沉迷於淫亂、食用魚鳥、賄賂金銀」。所以不能說信長天下布武的戰略中從一開始就有以武力消滅舊勢力的政策。
之所以這麼說，是因為與比叡山齊名的舊勢力代表東寺（真言宗）、賀茂社和北野社等許多寺社都接受了「當知行安堵」，信長雖然向大和派去兩萬大軍，但也根本沒動興福寺、東大寺、春日社、法隆寺等地。只有比叡山是例外。基本上，信長並沒有採取否定寺社本所和權勢之家的政策。火燒比叡山只是為了警示本願寺和一向一揆。
十七條意見書
本願寺顯如仍在努力集結反信長勢力。元龜元年年底，他寫信給武田信玄，終於說服了信玄加入反信長同盟。松永久秀也加入他們，並向信玄示好。元龜二年五月，信玄回覆說願意上洛，並承諾協助。在信中，信玄指出義昭「對信長積怨已深，定會為討伐信長而行動」，反信長陣營已預料到義昭會舉兵。而義昭當時雖然表面上還沒有什麼動作，但已在私下與各地的反信長勢力聯絡，準備起事。
覺察到義昭的舉動後，信長於元龜三年九月向義昭發出了相當於最後通牒的十七條意見書。在第一條中，信長先搬出朝廷指責義昭，讓他難以反駁——說上洛的時候就提醒義昭不要怠慢朝廷，結果義昭早就忘了這回事，根本沒有好好侍奉。還說第十三代將軍義輝就是因為怠慢了天皇才會被殺——把整件事說成天罰，以此轉移重點，掩蓋兩人權力鬥爭的本質。這樣一來，即便信長討伐了義昭，也是義昭不義招致天罰——用這種邏輯就可以將信長自己的行為正當化。就這樣，信長開始利用朝廷對義昭進行激烈的人身攻擊。第二條指出，兩年前兩人約定向諸國下發御內書時必須有信長的附文，而義昭違背了約定。這一條也令人無法反駁。他還指責義昭沒有將知行分封給奉公和盡忠之人，令人寒心。除此之外，在與德政令有關的訴訟、代官職的訴訟、對糾紛的判決等問題上，他也指責義昭的裁判和處理方式欠妥。
義昭因為忙於為舉兵做準備，將重要物資和諸國進貢的金銀都轉移到了隱蔽之處，還把城內的儲備米也賣掉換成了金銀。信長對這些具體行為也提出了非難。對於換金一事，信長嚴厲指責他說：「公方（將軍）行買賣之事，古今未見。」換句話說，將軍居然做起生意來了，簡直是聞所未聞。他還說，義昭的這一系列行為讓京都百姓不安，下面的人都覺得將軍要拋棄京都了。
最後，在第十七條中，他利用世人輿論給了義昭致命一擊：「世人都說將軍慾壑難填，不辨是非，不顧廉恥，當地居民和百姓都叫你『惡御所』。聽說嘉吉之亂時被赤松滿祐殺死的第六代將軍足利義教也遭時人非議。為何人們都這麼說？你該好好想一想。」
說這些話，顯然是已經不打算與義昭共存了。第一條和第十七條還舉出被臣下殺死的將軍之名，等於宣告義昭也像他們一樣，被殺也不冤枉。被逼到這一步，義昭除了舉兵反抗以外已經無路可走了。而這正中信長下懷。義昭背叛恩人信長，信長只好反擊——通過這種方式，信長就可將戰爭行為正當化。
織田、上杉同盟
元龜三年（1572）年初，以本願寺、武田信玄、朝倉義景、淺井長政為中心的反信長同盟成立。本願寺則推動三好義繼和細川昭元等畿內勢力集結。松永久秀也加入後，東南西北四個方向的信長包圍網就形成了。信玄還試圖聯手遭信長火燒的比叡山勢力。信長陷入了四面楚歌的危機。
三月十九日，上杉謙信建議信長，要想擺脫當下的危機，應該趕在信玄之前提出復興比叡山的計劃，並與淺井長政議和。在此基礎上，謙信、信長和家康三人商量好一起征討信玄，然後再討伐淺井和其他勢力即可。顯然他們最害怕的還是信玄。
七月，信長糾集大軍出兵江北，攻打淺井長政。恰逢嫡長子奇妙（織田信忠）首次上戰場，父子共同上陣，就像是下定了攻克小谷城的決心一般。信長動員江南各村的農民，在虎御前山建起堅固的要塞作為進攻據點。對此，朝倉義景出動救援大軍，於七月底進入江北。於是信長只好暫停攻勢，加固了要塞，然後於九月中旬撤退。但是在八月八日，朝倉義景的重臣前波吉繼父子臨陣倒戈信長，其他人也紛紛效仿。這大概是因為朝倉義景的軍中也醞釀著對前途的不安。
信長撤退是為了防備信玄。他向謙信求援，十一月，謙信的使者送來誓詞，信長當著他的面寫下血書，雙方正式結盟。信長希望謙信攻打信玄的領地信濃和上野，但北陸地區越中和加賀的一向一揆、關東地區於前一年底重新與信玄結盟的北條氏同時進攻謙信，牽制了其行動。
三方原之戰
信玄在九月底先派由山縣昌景率領的別動隊向家康領地三河的東部進發，十月三日又親率大軍從甲府南下，進入遠江後，先包圍了二俁城（今靜岡縣濱松市），十二月十九日破城，但之後沒有繼續攻打濱松城，而是從城北西進，占領了三方原（同縣濱松市）高地。信玄的戰略十分明智。他的使命是盡最快速度西進以便夾擊信長。即便此時包圍濱松城，至少也要幾十天才能攻克。因此他判斷與其浪費時間，還不如把對方引誘到高地上來一決勝負。
而家康的任務，則是為盟友信長阻止信玄西進。所以他也不能穩坐濱松城內，眼睜睜地看著信玄軍西進。信長派來的援軍只有三千人，家康也只有八千人左右，而武田軍則號稱有兩萬多。雖然眼見毫無勝算，但在二十二日傍晚，家康軍還是從武田軍背後發動了攻勢。這就是三方原之戰。武田軍立刻應戰並打敗了德川軍。德川軍潰退，以援軍將領平手泛秀為首的許多人殞命，家康也只能狼狽逃回濱松城。這是家康平生最大的敗仗。
信玄馬上向朝倉義景報告了這場勝利，說自己打敗並俘虜了三河、遠江的兇徒和信長的上千名援軍。這場勝利極大地鼓舞了淺井和顯如等人，也促使義昭在第二年年初就匆匆叛離。但是，朝倉義景卻已於十二月三日率軍踏上了歸途。同月二十八日，信玄在給朝倉義景的信中表達了憤怒。他說如今「滅亡信長的時刻到來」，想要說服義景不要放鬆對江北的防備。但是義景已經出征四個多月，將士們疲勞不堪，兵糧也快要見底，恐怕難以繼續在雪深寒冷的江北布陣了。不過，儘管是無奈之舉，但義景的撤軍卻在信長包圍網上打開了一個豁口。信玄和顯如後來還幾次要求義景出兵，但他都沒有聽從。
一個更大的打擊是信玄的病情。信玄於天正元年（1573）年初就開始進軍三河，圍攻菅沼定盈盤踞的野田城（今愛知縣新城市）。遇到守軍頑強抵抗後，信玄軍便讓礦工挖地洞，抽掉城中的地下水，二月中旬終於破城。但是，信玄此時的病情已經相當嚴重，進軍到長筱（同縣新城市）後便不得不放棄西進了。隨後，四月十二日，在歸國途中的信濃伊那谷駒場，信玄走完了自己五十三年的人生。雖不能確定他的病因，但據說是肝肺有問題，一般認為是肺結核。信玄在與信長對峙時是否抱有明確的政權構想，我們不得而知。但無疑他曾試圖進入權力中心。大業未竟而身先死，其遺憾可想而知。
據說，臨終時，信玄曾留下遺言，命人將自己的死訊保守三年。事實上信玄的葬禮確實是在三年後的天正四年四月十六日舉行的，地點在菩提寺。但實際上早在當年的四月二十五日，飛驒的河上富信就把信玄的死訊傳給了謙信。對信長來說，沒有比這更幸運的事了，可謂抓住了起死回生的機會。相反，對反信長陣營來說，卻沒有比這更倒霉的事了。
義昭舉兵
下面讓我們來看看義昭的行動。義昭在反信長同盟的形成過程中發揮了非常重要的作用，他一直在尋找舉兵的機會。義昭最為期待的是信玄的西進作戰。所以在聽到三方原之戰勝利的消息後，他興奮異常，終於在第二年的二月舉起了反旗。一下子陷入絕境的信長希望與義昭議和，但對方根本沒有理會。從京都到近江，義昭的追隨者紛紛湧現。
三月二十五日，信長從岐阜出發上洛。義昭重臣細川藤孝和荒木村重在逢坂迎接他，並表示效忠。二人已與義昭決裂。四月三日，信長在洛外放火，逼義昭進行和談，但沒有得到回應。次日，信長包圍了義昭的御所，並在上京放火。這時天皇敕使出面調停，二人便立刻握手言和。但信長看出總有一天還會與義昭為敵，於是命人在近江建造了能一次性運送大量軍隊的大船。不出兩個月，便造出了長50米左右、有上百支船槳、船頭船尾都設有箭樓的大船。
七月三日，義昭躲進位於宇治川中洲的槙島城閉城不出。信長率軍乘剛造好的大船渡過琵琶湖，迅速從四面攻克槙島城外圍，並火攻主城。義昭毫無招架之力，只能投降。信長命義昭交出幼子義尋作人質，再命羽柴秀吉把義尋送往河內若江城（三好義繼守城）。《信長公記》記載說，當時人們都諷刺義昭為「貧窮公方」。後來，義昭又從紀伊國由良（今和歌山縣由良町）逃到備後的鞆（今廣島縣福山市）。他並沒有因此失去將軍的官職，此後也一直被稱作公方，繼續與各地大名聯繫，試圖打倒信長。他在毛利氏的庇護下，等待著上洛的機會。有人因此高度評價義昭作為將軍的立場。但是，義昭的敗北意味著作為中央政權的室町幕府已經名實皆無，可以說室町幕府就此滅亡。
回到京城的信長為了復興被燒毀的上京，免除了該地區的地子錢和各種徭役；任命村井貞勝為所司代（相當於幕府要職侍所頭人［所司］的代官），掌握了京城的警察權和統治權；又於七月二十八日改元天正，實現了義昭一直不情願實行的改元。這些行動，充分顯示了信長掌握天下的志向。
朝倉、淺井滅亡
不久，信長開始準備攻打淺井和朝倉。義昭的失勢，引起江北各勢力的動盪。及至信長出兵攻打，有些人便馬上倒向他。雖然這一回朝倉義景也率大軍前來援助，但一受到織田軍的直接攻擊就馬上撤退了。義景倉皇逃回一乘谷，後又棄城，一直退到大野郡。最後遭族人朝倉景鏡出賣，於八月二十八日被迫自殺。義景的母親、妻妾、嫡男愛王丸等人也在被捕後遭處決。延續五代、擁有百年歷史的戰國大名朝倉氏就此滅亡，城下町一乘谷也化為灰燼。
景鏡帶著義景的首級投靠了信長，其他許多臣下也紛紛投降，成為織田的家臣並存活下來。正好於一年前倒戈信長的前波吉繼被任命為「守護代」，統治越前國。
信長立即將大軍撤回了近江。失去朝倉援軍的淺井長政孤立無援，難以固守孤城。八月二十七日夜，羽柴秀吉攻進小谷城的京極丸，切斷了淺井久政與淺井長政的聯繫，久政先被打敗。次日，經過激烈的戰鬥，長政也自殺身亡。至此，號稱下克上之雄的淺井氏也滅亡了。九月，信長在寫給毛利輝元等大名的信中說，信玄、朝倉義景以及義昭之所以與自己敵對，都是因為淺井父子，表露出極深的恨意。長政的嫡男萬福丸在關原被處以磔刑。信長的妹妹、嫁與長政的阿市聽從長政勸說，帶著三個女兒出城，投奔了信長。
至此，反信長同盟解體，信長終於擺脫了最大的危機。朝倉義景和淺井久政、淺井長政三人的首級被掛在京都的獄門示眾，後又被塗上生漆、貼上金箔，在次年正月信長與馬回眾的宴會上被當作裝飾。
淺井家的領地被賜給了征討有功的羽柴秀吉。這樣，秀吉初次成為「國持大名」，在琵琶湖畔的長濱修建了居城。