宋南安太守杜寶之女杜麗娘正當青春年華，但受封建禮教的束縛，心情深受壓抑。一天，她在丫環春香的鼓動下遊覽了府中的花園，花園中百花爭艷的美麗春色深深地觸動了她的心。於是，她抱怨父母只知選擇門當戶對的女婿，而使自己青春虛度，深埋於內心中的感情也找不到可以傾訴的人。在這種苦悶的心情下，她昏昏入睡進入夢境。夢境中，她在花園裡遇到了青年秀才柳夢梅，兩人一見傾心，互訴愛慕之情，共成雲雨之歡。她的真情在夢中得到了無拘無束的表露，然正當兩情綿綿難捨難分之際，杜母進房叫醒了麗娘，打斷了她的美妙夢境。此後，杜麗娘因難忘夢中戀人，再尋而不可得，終於鬱悶成疾，相思而死。這是恰逢杜寶奉旨升遷，命他立即北上鎮守淮陽，只得暫時把杜麗娘埋葬在花園內梅樹下，並把花園改為尼庵（梅花庵）。
三年後，青年秀才柳夢梅在進京赴考途中，路經南安，偶感風寒，暫寄梅花庵養病。一天，他散步至花園，在假山石下拾得一幅畫卷，展開一看，原來是杜麗娘生前病中的自畫像，上有題詩曰：「……他年得傍蟾宮客，不在梅邊在柳邊」。詩意暗示著杜麗娘將來要嫁給姓柳的或是姓梅的。柳夢梅從前並不叫夢梅，是他曾得一夢，夢至一花園，見一美女站在梅花樹下，含情脈脈地對他說：當你遇到我後方有姻緣之分，發跡之期，從此他才改名為「夢梅」。他的姓名中既有柳字又有梅字，所以當他看到此詩和畫後，浮想連翩，相思之情陡起，日夜頂禮膜拜，亟盼早得相會，那怕是在夢中一會也好。柳夢梅的真情，感動了杜麗娘的遊魂，她不顧一切地前來與他幽會。在人與鬼的幽會中，他們擺脫了現實世界中的種種拘束，盡情表達相互間的愛情，雙雙對於盟誓，認為百年夫妻。情真意深的愛情，終於使杜麗娘起死回生。
之後，柳夢梅趕考完畢，沒等到發榜就拿著畫捲去找杜寶認親，誰知卻被當作盜墓賊而受拷打，而當還生的杜麗娘到來時，杜寶又認為妖精而不予相認。最後，由皇帝出面調停，以傳統的大團圓結束全劇。
《牡丹亭》寫「情」也，這已由作者在「題詞」中表明，也是古今評論家的共識。然而，《牡丹亭》中所表達的「情」，絕不僅僅是杜麗娘、柳夢梅兩位青年之間的這段愛情故事而已。湯顯祖通過此劇是謳歌人本性中所具有的真實感情，揭示現實社會生活中人的真實感「情」與維護社會倫理綱常的「理」之間的矛盾和鬥爭。
明王朝奉程朱理學為學術的唯一正統、為維護社會倫理綱常的理論基礎，以理學取士，以理學教民。程朱理學尊「天理」（以三綱五常為核心的封建禮教）而抑「人慾」，其流弊一至於凡事「恆以理相格」，即事事都要用「天理」來衡量一番，而不問其是否符合人的真實感情。誠如湯顯祖在《牡丹亭題詞》中所尖銳指出的，那些囿於理學藩籬的人只會說「這是天理所絕不允許的」，那裡知道「這在人性真情中是必定有的」（「第雲理之所必無，安知情之所必有邪」）！肯定人性中必定有的真情，破除「恆以理相格」的藩籬，這就是《牡丹亭》一劇的中心主旨之所在。
《牡丹亭》中反映出來的這一主旨，是與湯顯祖生活的時代（十六世紀）密切相關的。中國封建社會發展到明代中後期，其內部矛盾日益尖銳，在社會經濟生活中已緩慢地萌發出了某些資本主義性質的生產關係因素，市民階層的生活方式和思想觀念也開始在社會上發生相當的影響。傳統的程朱理學，已難以象原來那樣起到維繫人心、鞏固封建統治秩序的有效作用。於是，在一部分知識分子中出現了一股懷疑程朱理學絕對權威的思潮，並進而對程朱理學以理制情的理論發出了某種抗議和批判。王陽明心學理論的出現，是一個重要的標誌。
藝術的批判不同於理論的批判。理論的批判是要以理服人，而藝術的批判則是要以情感人。在中國傳統文化中，戲劇歷來有「高台教化」之稱，即通過戲劇藝術的演出來影響人的思想，轉變社會的風氣。湯顯祖是十分重視戲劇的這種社會教化作用的，而且認為戲劇是他「講情」思想的最好表達方式。相傳曾有人對湯顯祖說：以你的辯才而登教席，絕不在周、程、朱之下，可是我為什麼留戀於歌舞戲劇之中，豈不要讓學子們見笑？湯顯祖回答說：這是因為你講的是性的問題，而我講的是情的問題。《牡丹亭》中深刻的思想主題正是通過高超的藝術傳情手法體現出來的。
在《牡丹亭》中，湯顯祖通過編織夢和醒、死和生等曲折離奇的故事情節，突顯出理想與現實、情與理之間的矛盾。作者十分喜歡寫夢，也十分擅長於寫夢。在他人的四部戲劇作品中，「夢」都是故事結構中的重要環節，並由夢而搬演出一場場曲折離奇、引人入勝、感人肺腑的戲來。湯氏在解釋他的劇作中為什麼都離不開夢時說：「因情成夢，因夢成戲」（《湯顯祖集》卷四十七《復甘義麓》）。這是說，夢是情的反映，寫夢也就是寫情。所謂「因情成夢」，也就是人們常說的「日有所思，夜有所夢」。夢是一個人的事，夢中的景象也只有做夢者自己知道，因此，夢中之境不需要有任何的掩飾。夢境是人們內心最真實情感的表露，一個美麗的夢通常是一個人的追求和嚮往的反映。
湯顯祖正是運用了夢的這種特點，安排了杜麗娘與柳夢梅的夢境。柳夢梅的夢寫得十分簡單，只是通過他自己的敘述交代一下，為以後他與杜麗娘的相會設一伏筆。而對杜麗娘夢則編寫得細緻入微，有聲有色。劇本《驚夢》一折，從麗娘遊園寫起，細緻地描述了她如何因園中之景而引發起埋藏於內心深處的感情。其中，[山坡羊]一曲，麗娘傾吐內心之幽怨，情真意切、纏綿悱惻，聽者將無不為之動容。麗娘正是由此「情」因而進入夢境的。接著，在夢中，麗娘在美麗的花園裡見到了她心目中嚮往的情人。其間雖然免不了少女初次與異性接觸的羞澀，但她卻大膽地投入情人的懷抱，兩情交融，暢其歡快。然而，正當麗娘在夢中與柳夢梅難捨難分之時，卻被杜母的到來而打斷，而且當她醒來之後，立即遭到了杜母的嚴辭教訓，要她遵循「女孩兒只合香閨坐」（《慈戒》一折中杜母語），不得超越禮教藩籬一步。這裡，湯氏通過這一夢一醒的情節安排，顯示了理想與現實、情與理的強烈對比，激發起人們對「恆以理相格」的現實生活中封建禮教的抗爭。