GB 5009.158-2016 食品安全國家標準
食品中維生素K1的測定
前 言
本標準代替GB/T5009.158-2003《蔬菜中維生素K1 的測定》和GB5413.10-2010《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素K1 的測定》。
本標準與GB/T5009.158-2003相比，主要變化如下：
——標準名稱修改為「食品安全國家標準 食品中維生素K1 的測定」；
——增加了高效液相色譜-螢光檢測法；
——增加了液相色譜-串聯質譜法；
——刪除了高效液相色譜-紫外檢測法。
1 範圍
本標準規定了食品中維生素K1 的測定方法。
本標準第一法為高效液相色譜-螢光檢測法，第二法為液相色譜-串聯質譜法，均適用於各類配方食品、植物油、水果和蔬菜中維生素K1 的測定。
第一法 高效液相色譜-螢光檢測法
2 原理
嬰幼兒食品和乳品、植物油等樣品經脂肪酶和澱粉酶酶解，正己烷提取樣品中的維生素K1 後，用C18液相色譜柱將維生素K1 與其他雜質分離，鋅柱柱後還原，螢光檢測器檢測，外標法定量。水果、蔬菜等低脂性植物樣品，用異丙醇和正己烷提取其中的維生素K1，經中性氧化鋁柱淨化，去除葉綠素等干擾物質。用C18液相色譜柱將維生素K1 與其他雜質分離，鋅柱柱後還原，螢光檢測器檢測，外標法定量。
3 試劑和材料
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的一級水。
3.1 試劑
3.1.1 無水乙醇（CH3CH2OH）。
3.1.2 碳酸鉀（K2CO3）。
3.1.3 無水硫酸鈉（Na2SO4）。
3.1.4 異丙醇（C3H8O）。
3.1.5 正己烷（C6H14）。
3.1.6 甲醇（CH3OH）：色譜純。
3.1.7 四氫呋喃（C4H8O）：色譜純。
3.1.8 乙酸乙酯（C4H8O2）。
3.1.9 冰乙酸（CH3COOH）：色譜純。
3.1.10 氯化鋅（ZnCl2）：色譜純。
3.1.11 無水乙酸鈉（CH3COONa）。
3.1.12 氫氧化鉀（KOH）。
3.1.13 脂肪酶：酶活力≥700U/mg。
3.1.14 澱粉酶：酶活力≥1.5U/mg。
3.1.15 鋅粉：粒徑50μm~70μm。
3.2 試劑配製
3.2.1 40%氫氧化鉀溶液：稱取20g氫氧化鉀於100mL燒杯中，用20mL水溶解，冷卻後，加水至50mL，儲存於聚乙烯瓶中。
3.2.2 磷酸鹽緩衝液（pH8.0）：溶解54.0g磷酸二氫鉀於300mL水中，用40%氫氧化鉀溶液調節pH至8.0，加水至500mL。
3.2.3 正己烷-乙酸乙酯混合液（90+10）：量取90mL正己烷，加入10mL乙酸乙酯，混勻。
3.2.4 流動相：量取甲醇900mL，四氫呋喃100mL，冰乙酸0.3mL，混勻後，加入氯化鋅1.5g，無水乙酸鈉0.5g，超聲溶解後，用0.22μm 有機系濾膜過濾。
3.3 標準品
維生素K1（C31H46O2，CAS號：84-80-0）：純度≥99%，或經國家認證並授予標準物質證書的標準物質。
3.4 標準溶液配製
3.4.1 維生素K1 標準貯備溶液（1mg/mL）：準確稱取50mg（精確至0.1mg）維生素K1 標準品於50mL容量瓶中，用甲醇溶解並定容至刻度。將溶液轉移至棕色玻璃容器中，在-20 ℃下避光保存，保存期2個月。標準儲備液在使用前需要進行濃度校正，校正方法參照附錄A。
3.4.2 維生素K1 標準中間液（100μg/mL）：準確吸取標準貯備溶液10.00mL於100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。將溶液轉移至棕色玻璃容器中，在-20℃下避光保存，保存期2個月。
3.4.3 維生素K1 標準使用液（1.00μg/mL）：準確吸取標準中間液1.00mL於100mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。
3.4.4 標準系列工作溶液：分別準確吸取維生素K1 標準使用液0.10mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL於10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，維生素K1 標準系列工作溶液濃度分別為10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL。
3.5 材料
3.5.1 中性氧化鋁：粒徑50μm~150μm。
3.5.2 中性氧化鋁柱：2g/6mL，填料中含10%水，可直接購買商品柱，也可自行裝填。
註：中性氧化鋁柱裝填方法：
a） 填料處理：取200g中性氧化鋁於500mL的廣口瓶中，於150℃乾燥箱中烘烤2h，加蓋後於乾燥器中冷卻至室溫，緩慢加入20mL純水，邊加邊搖，加完後加上瓶蓋，放入80℃烘箱中3min~5min，取出後，劇烈振搖，直至瓶內氧化鋁自由流動，無結塊，置於乾燥器中冷卻30min，備用。
b） 層析柱裝填：取6mL的針筒式柱套，加入篩板，稱取2.00g上述經脫活化處理的填料，再加入一塊篩板，用裝填工具壓緊。
3.5.3 鋅柱：柱長50mm，內徑4.6mm，鋅柱可直接購買商品柱，也可自行裝填。
註：
a） 鋅柱填裝方法：將鋅粉密集裝入不鏽鋼材質的柱套（柱長50mm，內徑4.6mm）中。裝柱時，應連續少量多次將鋅粉裝入柱中，邊裝邊輕輕拍打，以使裝入的鋅粉緊密。
b） 鋅柱接入儀器前，須將液相色譜儀所用管路中的水排乾。
3.5.4 微孔濾頭：帶0.22μm 有機系微孔濾膜。
4 儀器和設備
4.1 高效液相色譜儀：帶螢光檢測器。
4.2 勻漿機。
4.3 高速粉碎機。
4.4 組織搗碎機。
4.5 渦旋振盪器。
4.6 恆溫水浴振盪器。
4.7 pH 計：精度0.01。
4.8 天平：感量為1mg和0.1mg。
4.9 離心機：轉速≥6000r/min。
4.10 旋轉蒸發儀。
4.11 氮吹儀。
4.12 超聲波振盪器。
5 分析步驟
5.1 試樣製備
米粉、奶粉等粉狀樣品經混勻後，直接取樣；片狀、顆粒狀樣品，經樣本粉碎機磨成粉，儲存於樣品袋中備用；液態乳、植物油等液態樣品搖勻後，直接取樣；水果、蔬菜等取可食部分，水洗乾淨，用紗布擦去表面水分，經勻漿器勻漿，儲存於樣品瓶中備用。制樣後，需儘快測定。
5.2 試樣處理
警示：處理過程應避免紫外光直接照射，儘可能避光操作。
5.2.1 嬰幼兒食品和乳品、植物油
5.2.1.1 酶解
準確稱取經均質的試樣1g~5g（精確到0.01g，維生素K1 含量不低於0.05μg）於50mL離心管中，加入5mL溫水溶解（液體樣品直接吸取5mL，植物油不需加水稀釋），加入磷酸鹽緩衝液（pH8.0）5mL，混勻，加入0.2g脂肪酶和0.2g澱粉酶（不含澱粉的樣品可以不加澱粉酶），加蓋，渦旋2min~3min，混勻後，置於37℃±2℃恆溫水浴振盪器中振盪2h以上，使其充分酶解。
5.2.1.2 提取
取出酶解好的試樣，分別加入10mL乙醇及1g碳酸鉀，混勻後加入10mL正己烷和10mL水，渦旋或振盪提取10min，6000r/min離心5min，或將酶解液轉移至150mL的分液漏斗中萃取提取，靜置分層（如發生乳化現象，可適當增加正己烷或水的加入量，以排除乳化現象），轉移上清液至100mL旋蒸瓶中，向下層液再加入10mL正己烷，重複操作1次，合併上清液至上述旋蒸瓶中。
5.2.1.3 濃縮
將上述正己烷提取液旋蒸至干（如有殘液，可用氮氣輕吹至干），用甲醇轉移並定容至5mL容量瓶中，搖勻，0.22μm 濾膜過濾，濾液待進樣。
不加試樣，按同一操作方法做空白試驗。
5.2.2 水果、蔬菜樣品
5.2.2.1 提取
準確稱取1g~5g（精確到0.01g，維生素K1 含量不低於0.05μg）經均質勻漿的樣品於50mL離心管中，加入5 mL 異丙醇，渦旋1 min，超聲5 min，再加入10 mL 正己烷，渦旋振盪提取3 min，6000r/min離心5min，移取上清液於25mL棕色容量瓶中，向下層溶液中加入10mL正己烷，重複提取1次，合併上清液於上述容量瓶中，正己烷定容至刻度，用移液管準確分取上清液1mL~5mL（視樣品中維生素K1 含量而定）至10mL試管中，氮氣輕吹至干，加入1mL正己烷溶解，待淨化。
5.2.2.2 淨化、濃縮
將上述1mL提取液用少量正己烷轉移至預先用5mL正己烷活化的中性氧化鋁柱中，待提取液流至近干時，5mL正己烷淋洗，6mL正己烷-乙酸乙酯混合液洗脫至10mL試管中，氮氣吹乾後，用甲醇定容至5mL，過0.22μm 濾膜，濾液供分析測定。
不加試樣，按同一操作方法做空白試驗。
5.3 色譜參考條件
a） 色譜柱：C18柱，柱長250mm，內徑4.6mm，粒徑5μm，或具同等性能的色譜柱；
b） 鋅還原柱：柱長50mm，內徑4.6mm；
c） 流動相：按3.2.4配製；
d） 流速：1mL/min；
e） 檢測波長：激發波長為243nm，發射波長為430nm；
f） 進樣量：10μL；
g） 標準溶液的色譜圖見附錄B。
5.4 標準曲線的製作
採用外標標準曲線法進行定量。將維生素K1 標準系列工作液分別注入高效液相色譜儀中，測定相應的峰面積，以峰面積為縱坐標，以標準系列工作液濃度為橫坐標繪製標準曲線，計算線性回歸方程。
5.5 試樣溶液的測定
在相同色譜條件下，將製備的空白溶液和試樣溶液分別進樣，進行高效液相色譜分析。以保留時間定性，峰面積外標法定量，根據線性回歸方程計算出試樣溶液中維生素K1 的濃度。
6 分析結果的表述
試樣中維生素K1 的含量按式（1）計算：
式中：
X ——試樣中維生素K1 的含量，單位為微克每百克（μg/100g）；
ρ ——由標準曲線得到的試樣溶液中維生素K1 的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；
V1 ——提取液總體積，單位為毫升（mL）；
V3 ——定容液的體積，單位為毫升（mL）；
100 ——將結果單位由微克每克換算為微克每百克樣品中含量的換算係數；
m ——試樣的稱樣量，單位為克（g）；
V2 ——分取的提取液體積（嬰幼兒食品和乳品、植物油V1=V2），單位為毫升（mL）；
1000——將濃度單位由ng/mL換算為μg/mL的換算係數。
計算結果保留三位有效數字。
7 精密度
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
8 其他
嬰幼兒食品和乳品、植物油，當取樣量為1g，定容5 mL 時，檢出限為1.5μg/100g，定量限為5μg/100g；果蔬樣品當取樣量為5g，提取液分取5mL，定容5mL時，檢出限為1.5μg/100g，定量限為5μg/100g。
第二法 液相色譜-串聯質譜法
9 原理
嬰幼兒食品和乳品、植物油等樣品經脂肪酶和澱粉酶酶解，用正己烷提取樣品中的維生素K1 後，用C18液相色譜柱將維生素K1 與其他雜質分離，串聯質譜檢測，同位素內標法定量。
水果、蔬菜等低脂性植物樣品，用異丙醇和正己烷提取其中的維生素K1，經中性氧化鋁柱淨化，去除葉綠素等干擾物質。用C18液相色譜柱將維生素K1 與其他雜質分離，串聯質譜檢測，同位素內標法定量。
10 試劑和材料
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的一級水。
10.1 試劑
10.1.1 無水乙醇（CH3CH2OH）。
10.1.2 碳酸鉀（K2CO3）。
10.1.3 氫氧化鉀（KOH）。
10.1.4 甲酸（HCOOH）：色譜純。
10.1.5 甲酸銨（HCOONH4）：色譜純。
10.1.6 異丙醇[（CH3）2CHOH]。
10.1.7 正己烷[CH3（CH2）4CH3]。
10.1.8 甲醇（CH3OH）：色譜純。
10.1.9 乙酸乙酯（C4H8O2）。
10.1.10 脂肪酶：酶活力≥700U/mg。
10.1.11 澱粉酶：酶活力≥1.5U/mg。
10.2 試劑配製
10.2.1 40%氫氧化鉀溶液：稱取20g氫氧化鉀於100mL燒杯中，用20mL水溶解，冷卻後，加水至50mL，儲存於聚乙烯瓶中。
10.2.2 磷酸鹽緩衝液（pH8.0）：溶解54.0g磷酸二氫鉀於300mL水中，用40%氫氧化鉀溶液調節pH至8.0，加水至500mL。
10.2.3 正己烷-乙酸乙酯混合液（90+10）：量取90mL正己烷，加入10mL乙酸乙酯，混勻。
10.2.4 流動相：1000mL甲醇中加入0.25mL甲酸和0.1575g甲酸銨，超聲溶解後，用0.22μm有機系濾膜過濾。
10.3 標準品
10.3.1 維生素K1（C31H46O2，CAS號：84-80-0）：純度≥99.3%。
10.3.2 維生素K1-D7（C31H46O2，CAS號：1233937-39-7）：純度≥99.5%。
10.4 標準溶液配製
10.4.1 維生素K1 標準貯備溶液（1mg/mL）：準確稱取50mg（精確至0.1mg）維生素K1 標準品於50mL 容量瓶中，用甲醇溶解並定容至刻度。將溶液轉移至棕色玻璃容器中，在-20℃下避光保存，保存期2個月。標準儲備液在使用前需要進行濃度校正，校正方法參照附錄A。
10.4.2 維生素K1 標準中間液（100μg/mL）：準確吸取維生素K1 標準貯備溶液10.00mL於100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。將溶液轉移至棕色玻璃容器中，在-20℃下避光保存，保存期2個月。
10.4.3 維生素K1 標準使用液（1μg/mL）：準確吸取維生素K1 標準中間液1.00mL於100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。
10.4.4 維生素K1-D7 同位素內標貯備溶液（100μg/mL）：準確稱取1mg（精確至0.01mg）維生素K1-D7 同位素內標，用甲醇溶解並定容至10mL。
10.4.5 維生素K1-D7 同位素內標使用液（1μg/mL）：吸取維生素K1-D7 同位素內標貯備溶液1.00mL於100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。
10.4.6 標準系列工作溶液：分別準確吸取維生素K1 標準使用液0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、
1.00mL、2.00mL、4.00mL於10mL容量瓶中，各加入同位素內標使用液0.50mL，加甲醇定容至刻度，此標準系列工作液維生素K1 濃度分別為10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、
200ng/mL、400ng/mL。
10.5 材料
10.5.1 中性氧化鋁：粒徑50μm~150μm。
10.5.2 中性氧化鋁柱：2g/6mL，填料中含10%水，可直接購買商品柱，也可自行裝填。
註：中性氧化鋁柱裝填方法：
a） 填料處理：取200g中性氧化鋁於500mL的廣口瓶中，於150℃乾燥箱中烘烤2h，加蓋後於乾燥器中冷卻至室溫，緩慢加入20mL純水，邊加邊搖，加完後加上瓶蓋，放入80℃烘箱中3min~5min，取出後，劇烈振搖，直至瓶內氧化鋁自由流動，無結塊，置於乾燥器中冷卻30min，備用。
b） 層析柱裝填：取6mL的針筒式柱套，加入篩板，稱取2.00g上述經脫活化處理的填料，再加入一塊篩板，用裝填工具壓緊。
10.5.3 微孔濾頭：帶0.22μm 微孔濾膜。
11 儀器和設備
11.1 液相色譜-質譜聯用儀：帶電噴霧離子源（ESI）。
11.2 勻漿機。
11.3 高速粉碎機。
11.4 組織搗碎機。
11.5 渦旋振盪器。
11.6 恆溫水浴振盪器。
11.7 pH 計：精度0.01。
11.8 天平：感量1mg和0.1mg。
11.9 離心機：轉速≥6000r/min。
11.10 旋轉蒸發儀。
11.11 氮吹儀。
11.12 超聲波振盪器。
12 分析步驟
12.1 試樣製備
米粉、奶粉等粉狀樣品經混勻後，直接取樣；片狀、顆粒狀樣品，經樣本粉碎機磨成粉，儲存於樣品袋中備用；液態乳、植物油等液態樣品搖勻後，直接取樣；水果、蔬菜等取可食部分，水洗乾淨，用紗布擦去表面水分，經勻漿器勻漿，儲存於樣品瓶中備用。制樣後，需儘快測定。
12.2 試樣處理
警示：處理過程應避免紫外光照，儘可能避光操作。
12.2.1 嬰幼兒食品和乳品、植物油
12.2.1.1 酶解
準確稱取經均質的試樣1g~5g（精確到0.01g，維生素K1 含量不低於0.02μg）於50mL離心管中，加入同位素內標使用液（1μg/mL）0.25mL，加入5mL溫水溶解（液體樣品直接吸取5mL，植物油不需加水稀釋），加入磷酸鹽緩衝液（pH8.0）5mL，混勻，加入0.2g脂肪酶和0.2g澱粉酶（不含澱粉的樣品可以不加澱粉酶），加蓋，渦旋2min~3min，混勻後，置於37℃±2℃恆溫水浴振盪器中振盪2h以上，使其充分酶解。
12.2.1.2 提取
取出酶解好的試樣，分別加入10mL 乙醇及1g碳酸鉀，混勻後加入10mL 正己烷，渦旋提取10min，6000r/min離心3min，轉移上清液至另一50mL離心管中，向下層液再加入10mL正己烷，渦旋5min，6000r/min離心3min，合併上清液，正己烷定容至25mL，待淨化。
12.2.1.3 淨化
在上述提取液中加入20mL水，振搖0.5min，靜置分層後，分取5mL上清液於10mL的玻璃試管中，氮吹至干，加入1mL甲醇溶解，用0.22μm 濾膜過濾，濾液待進樣。
不加試樣，按同一操作方法做空白試驗。
12.2.2 水果、蔬菜樣品
12.2.2.1 提取
準確稱取1g~5g（精確到0.01g，維生素K1 含量不低於0.02μg）經均質勻漿的樣品於50mL離心管中，加入同位素內標使用液（1μg/mL）0.25mL，加入5mL異丙醇，渦旋1min，超聲5min，加入10mL 正己烷，渦旋振盪提取3min，6000r/min離心5min，移取上清液於25mL棕色容量瓶中，向下層溶液中再加入10mL正己烷，重複提取1次，合併上清液於上述容量瓶中，正己烷定容至刻度，用移液管準確分取上清液5mL至10mL試管中，氮氣輕吹至干，加入1mL正己烷溶解，待淨化。
12.2.2.2 淨化
將上述1mL提取液用少量正己烷轉移至預先用5mL正己烷活化的中性氧化鋁柱中，待提取液流至近干時，5mL正己烷淋洗，6mL正己烷-乙酸乙酯混合液洗脫至10mL試管中，氮氣吹乾後加入1mL 甲醇，過0.22μm 濾膜，濾液供分析測定。
不加試樣，按同一操作方法做空白試驗。
12.3 色譜參考條件
a） 色譜柱：C18柱，柱長50mm，內徑2.1mm，粒徑1.8μm，或具同等性能的色譜柱；
b） 流動相：甲醇（含0.025%甲酸+2.5mmol/L甲酸銨）；
c） 流速：0.3mL/min；
d） 柱溫：30℃；
e） 進樣量：5μL。
12.4 質譜參考條件
a） 電離方式：ESI+；
b） 鞘氣溫度：375℃；
c） 鞘氣流速：12L/min；
d） 噴嘴電壓：500V；
e） 霧化器壓力：172kPa；
f） 毛細管電壓：4500V；
g） 乾燥氣溫度：325℃；
h） 乾燥氣流速：10L/min；
i） 多反應監測（MRM）模式。
錐孔電壓和碰撞能量見表1，質譜圖見附錄C。
12.5 標準曲線的製作
將標準系列工作溶液按濃度由低到高注入液相色譜-質譜儀進行測定，測得相應色譜峰的峰面積，以標準系列工作溶液中維生素K1 的濃度為橫坐標，維生素K1 的色譜峰的峰面積與同位素內標色譜峰的峰面積的比值為縱坐標，繪製標準曲線。
12.6 試樣溶液的測定
將試樣溶液注入液相色譜-質譜儀進行測定，測得相應色譜峰的峰面積，根據標準曲線得到試樣溶液中維生素K1 的濃度。如試樣溶液中維生素K1 的濃度超出線性範圍，則需適當減少取樣量按12.2處理試樣後重新測定。
12.7 定性
試樣中目標化合物色譜峰的保留時間與標準色譜峰的保留時間相比較，變化範圍應在±2.5%之內。
待測化合物定性離子色譜峰的信噪比應≥3，定量離子色譜峰的信噪比應≥10。
每種化合物的質譜定性離子應出現，至少應包括一個母離子和兩個子離子，而且同一檢測批次，對同一化合物，樣品中目標化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當的標準溶液相比，其允許偏差不超過表2規定的範圍。
13 分析結果的表述
試樣中維生素K1 的含量按式（2）計算：
式中：
X ——試樣中維生素K1 的含量，單位為微克每百克（μg/100g）；
ρ ——由標準曲線得到的試樣溶液中維生素K1 的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；
V1 ——提取液總體積，單位為毫升（mL）；
V3 ——定容液的體積，單位為毫升（mL）；
100 ——將結果單位由μg/g換算為μg/100g樣品中含量的換算係數；
m ——試樣的稱樣量，單位為克（g）；
V2 ——分取的提取液體積，單位為毫升（mL）；
1000——將濃度單位由ng/mL換算為μg/mL的換算係數。
計算結果保留三位有效數字。
14 精密度
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
15 其他
嬰幼兒食品和乳品、植物油，當取樣量為1g，提取液分取5mL，濃縮後定容1mL 時，檢出限為
1.5μg/100g，定量限為5μg/100g；果蔬樣品當取樣量為5g，提取液分取5mL，濃縮後定容1mL時，檢出限為0.3μg/100g，定量限為1μg/100g。
轉載自：http://www.xpl-hplc.com/enstyle/articleinfo_11747595.html