癌症是一種慢性的基因疾病，主要是由正常體細胞發生基因突變而導致。在腫瘤惡性轉化和生長的過程中，有一小部分突變會促進促進腫瘤生長和惡性轉化，被稱為驅動突變（driver mutations）；而另一部分對細胞健康無害的突變，被稱為乘客突變（passengers）。有關於癌症基因突變的大量研究已為我們提供了很多的信息，從癌症預測，到診斷，再到預後多起到了很大的幫助。但是，人們依舊不清楚哪些突變是功能性癌症的驅動因素。因此，在相關癌症模型中高通量大規模研究這些基因，實現對驅動突變和乘客突變的分類，進一步識別基因組突變的「actionability「（可訴性）是癌症研究最迫切的需求。
現有的體外和體內模型對於確定癌症的生物學特性都有著極佳的效果，但每種模型都有其局限性。其中，基因工程小鼠模型涵蓋了腫瘤生長和微環境的變化，但受到量化成本高的限制；基於異種移植的模型在通量小，並且在體外很難操作；腫瘤生長和藥物敏感性的研究在很大程度上依賴於體外單層腫瘤模型（2D cell culture），這種模型缺乏許多疾病的特徵，如缺氧、細胞間接觸的改變和新陳代謝的改變；3D細胞培養緩解了其中的一些擔憂，但是想實現高通量仍是一個很大的挑戰。開發一種可高通量製備的3D腫瘤模型，以全基因組測序的方式來研究驅動基因的可訴性是迫在眉睫的。
目前3D細胞培養大致分為兩類：基於支架的和無支架的。常見的3D細胞培養支架是由細胞外基質形成的水凝膠（Hydrogels），很多3D 類器官都採用水凝膠支架培養。不依賴支架的 3D 細胞培養是指用超低細胞粘附板（通常96孔）、懸滴法、旋轉培養法或磁力懸浮法讓細胞形成3D球體。該研究以第一種方法為主，優化了甲基纖維素的濃度和接種細胞的密度，更利於3D腫瘤球的形成與生長。
來自美國史丹福大學醫學院的 Michael C. Bassik教授團隊在Nature 發表了題目為「CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities」的文章，通過可高通量製備的肺癌類器官模型，使用全基因組CRISPR篩查，為我們更進一步解析了2D模型和3D模型之間差異，如突變的頻率和驅動基因的富集程度，並建立了在3D腫瘤模型中進行CRISPR篩選來揭示癌症弱點的通用策略。
篩選思路（圖源自Nature ）
在2D腫瘤模型中通過CRISPR篩查已經可以得到豐富的信息，但是他們往往不是複製腫瘤生物學的關鍵方面，並且在2D培養過程中已知腫瘤抑制基因的表型為陰性。因此，作者以肺腺癌細胞系H23為研究對象，通過調整外基質中甲基纖維素的濃度以及單孔細胞接種密度實現高通量構建3D肺癌腫瘤模型。由於H23細胞本身含有KRAS（G12C）突變，利用CRISPR結合ARS-853（KRAS抑制劑）對2D和3D肺癌腫瘤模型進行篩選，結果表明，3D肺癌腫瘤模型的表型更接近真實癌組織，多為正生長表型，而反觀2D模型則多為負表型。
與此同時，對兩種模型進行更進一步的通路富集分析，3D肺癌模型以p53和RAS（H23細胞已知的驅動因素）等癌症特異性通路富集為主。2D模型則是以常見的基本細胞功能通路富集為主，如DNA複製。這可能是因為這些驅動基因控制著模型向更具侵略性的3D生長的過渡過程，這是腫瘤發生的標誌。其中可能包括與細胞黏附有關的基因或能夠響應球體中「類腫瘤」應激（例如缺氧或細胞擁擠）的基因。總而言之，這些數據表明，3D模型能夠更準確地捕捉到癌症基因和通路的特徵。
為了更系統地比較2D模型、3D模型與腫瘤異種移植模型之間的差異，研究者們建立一個由911個具備生長效應的前體分子構成的sgRNA庫，並以此對2D模型、3D模型與腫瘤異種移植模型進行比較。提出了更優的用於體內CRISPR篩選的方案，該方法可以從腫瘤異種移植物中獲得了高度可重複的數據。值得注意的是，來自3D模型的基因表型與小鼠異種移植中的基因表型比來自2D模型的基因表型更緊密相關。準確的腫瘤功能缺失表型體外建模可能成為治療策略個性化的重要手段，例如CREBBP抑制劑已經被用於治療各種癌症。然而，在這裡測試的某些肺癌株中，CREBBP基因敲除對2D癌症模型生長有負面影響，但對3D模型和小鼠異種移植模型的生長有積極影響。
鑒於這類模型表型的基因會因肺癌突變而富集，那麼，這些基因中也一定包含了新的治療靶點。羧肽酶D（CPD）是金屬羧酸肽酶家族中特性較差的成員，它能從多肽中裂解C末端精氨酸和賴氨酸，位於反式高爾基網絡中。它在2D腫瘤模型中無表現，但是在3D模型中有著明顯的表型。CPD的表達與肺癌患者的預後相關，而CPD的缺失可以有效地抑制腫瘤的生長，在3D模型中CPD缺失表現出與KRAS（G12C）抑制劑ARS-853明顯的協同效果。與此同時，CPD是通過調節胰島素樣生長因子1受體 （IGF1R）實現其功能的，它可以從IGF1R的α鏈上去除對其受體活性至關重要的C-末端RKRR基序，從而影響IGF1R的成熟與功能。 這也說明了IGF1R的表達或依賴性，以及KRAS的突變可能作為肺癌靶向CPD和KRAS（G12C）聯合治療的標誌物。
啟發與問題：
1、與2D腫瘤模型相比，3D腫瘤模型中細胞的表型更接近癌基因和腫瘤抑制因子的預期結果，並且與腫瘤異種抑制中的表型更一致。
2、每個癌症樣品呈現在研究人員眼前的已經是一個發生了改變的基因組，其中包含著獨特且難以預測的諸多點突變、序列的插入缺失、易位、融合以及其他畸變，因而為了能夠真正做到全面研究癌症基因組本身所發生的所有突變事件，全基因組測序應被視為腫瘤基因變異研究中 唯一 嚴謹的方法。
3、能夠系統地、大規模地確定腫瘤為響應獨特的驅動基因，將有助於改進藥物靶點識別模型以及更好地了解癌症的生長。
參考消息：
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2099-x