撰文 | Victoria
責編 | 兮
混合基因敲除篩選（Pooled genetic knockout screens）在功能基因組學界廣泛用於鑑定與細胞表型相關的基因【1】。但是這種篩選方法大多採用比較粗獷的篩選指標，如生長速率、合成致死和螢光報告等方法。近年來，隨著單細胞測序的普及，將其與混合基因敲除篩選法相結合，實現了全轉錄組範圍內的定量分析，大大提升了篩選的通量。但是，這些方法仍然不能對亞細胞層面的表型進行分析，如在成像層面能夠觀察到的時空解析度下的一些表型【2】。
2020年5月11日，加州大學聖地亞哥分校的華裔學者Gene W Yeo及其同事在Nature methods雜誌上發表題為Pooled CRISPR screens with imaging on microraft arrays reveals stress granule-regulatory factors的研究論文。在這篇文章中，作者將Pooled CRISPR-Cas9篩選與微筏陣列（microraft arrays）技術以及高內涵成像相結合，開發了新技術「CRaft-ID (CRISPR-based microRaft followed by guide RNA identification)」。通過分離含有具體單個嚮導RNA（gRNA）的基因克隆的微筏，確定影響應激顆粒（stress granules）形成的RNA結合蛋白（RBPs）。同時，作者開發了一種基於核形態學的機器學習模型來去除狀態不佳的細胞或成像假象，實現了自動識別功能。這種新的篩選平台具有廣泛的適用性和靈活性，可以被移植到各種基於成像層面的表型，是功能基因組學篩選的重大外延。
亞細胞表型是指發生在亞細胞層面的，與細胞特性和功能相關的生理和病理變化，如轉錄因子入核、蛋白質向特定細胞亞結構的定位，以及與疾病相關的蛋白質的錯誤聚集。廣義上講，由高通量成像無偏差地捕獲到的各種功能和形態，只要是對不同刺激發生響應的，均可稱為亞細胞表型。然而，目前對決定這些亞細胞表型的調控因子的篩選仍需要使用機器人平台的陣列方法，費時費力。最近，利用螢光標記的核苷酸和混合CRISPR文庫進行原位測序，再結合基於圖像的表型分析，已經被用於鑑定參與各種亞細胞表型的遺傳調控因子篩選，包括轉錄因子定位、大腸桿菌的細胞周期控制和長非編碼RNA定位等【3-5】。
在這項工作中，作者提出了一種在微筏陣列上進行混合CRISPR篩選（>12,000個sgRNAs）的新方法，隨後採用自動高解析度共聚焦成像來識別應激顆粒的調節因子。
應激顆粒是細胞應激過程中在細胞質中形成的蛋白-RNA聚集體，在氧化應激、熱休克和免疫激活等細胞干擾過程中形成。異常應激顆粒動力學與包括癌症和神經退行性變在內的多種疾病有關。蛋白質組學方法已經鑑定了定位於應激顆粒的多種蛋白質【6】，但是對於影響應激顆粒豐度的基因仍不清楚。因此，鑑定調節應激顆粒生物學的基因調節劑可能啟發新的疾病相關療法。微筏陣列與標準的細胞培養皿類似，適用於各種細胞類型（包括幹細胞及其分化成的各類細胞）。在微筏陣列上進行有限稀釋度的條件下鋪板後培養，上面的數千個克隆細胞集落（每個集落約5-20個細胞）彼此相互分離開。這些細胞集落儘管在陣列上彼此物理分離，但它們處於培養基是互通的，這就完全消除了由於處於不同培養條件所引起的人為誤差。早在分析的時候，可以將微筏從陣列中逐個取出，以便進行擴展培養或基因組分析。
圖1. 微筏陣列能夠對數以千計的克隆細胞進行培養和應激顆粒量化。
在這項工作中，作者開發了CRaft-ID，將基於圖像的應激顆粒表型分析與微筏陣列上的混合CRISPR篩選相結合。作者選用了包含>1,000個RBPs的gRNA文庫（> 12,000個sgRNA）對細胞進行了感染，然後在20個微筏陣列上進行單細胞培養，篩選得到119,050個應激刺激後的單細胞集落和5,262個未進行應激刺激的對照集落。值得注意的是，作者選用的gRNA庫就是通用的gRNA庫，所以這種方法可以簡單地拓展到多個領域。作者使用高內涵共聚焦顯微鏡進行成像，並開發了機器學習工具來識別CRISPR基因敲除後應激顆粒豐度降低的基因克隆。篩選確定並驗證了6種已知的應激顆粒調節因子以及17種新的RBPs。這項工作表明，將廣泛適用的混合CRISPR方法與微筏高內涵成像分析相結合，在識別影響亞細胞表型遺傳因素方面具有巨大潛力。
圖2. 利用CRaft-ID軟體進行圖像分析示意圖。
此前已有兩種基於成像的混合基因篩選方法，一種具有高解析度（RNA定位）和低通路特徵（54個基因，30,000個細胞）【5】。另外一種則是低解析度（核/質定位）和高通路（963個基因，3,000,000個細胞）【3】。CRaft-ID平台在通量（1078個基因，120,000個菌落）和解析度方面處於中間水平。而且，CRaft-ID使用傳統的基於PCR的測序方法來鑑定sgRNA，大大降低成本。
本實驗中，亞砷酸鈉處理對細胞是致死的，而應激顆粒的形成非常短暫，所以細胞在成像前進行了固定。其實，對於某些對細胞不致命的處理條件，CRaft-ID平台還適用於活細胞成像，從而捕獲內生標記蛋白質和細胞形態的動態定位模式，然後從陣列中分離活細胞集落以進行進一步的細胞實驗。
圖3. sgRNA靶點鑑定和驗證新的應激顆粒。
綜上所述，作者構建的CRaft-ID篩選平台拓展了CRISPR篩選在高內涵成像中的應用，使得我們能夠對亞細胞層面和細胞形態的表型進行遺傳因子分析，而這些在以前是無法實現的。由於該方法採用的Microcrft與標準的細胞培養類似、通用的CRISPR文庫、現成的共聚焦成像技術和基於PCR的DNA測序，因此具有廣泛的應用前景。作者證明了CRaft-ID能夠可靠地識別應激顆粒豐度調節因子器，為應激顆粒提供了新的生物學見解。
原文連結：
https://doi.org/10.1038/s41592-020-0826-8