撰文 | tac.G
責編 | 兮
細胞焦亡（Pyroptosis）是近年頗受關注的炎症性細胞死亡類型。在早期研究中，因感染引起的細胞的炎症性死亡曾一度被誤認為是細胞凋亡過程（Aptoptosis）。直到2001年，科研人員才關注由感染等引起的細胞死亡存在明顯的炎性進展，且形態學上與傳統的凋亡具有明顯區別，將這一類細胞死亡命名為焦亡。但此後的十幾年裡，細胞焦亡一直被定義為由炎症性Caspase（Caspase-1/4/5/11）引起的細胞炎症性死亡。
邵峰課題組在感染免疫和焦亡研究領域有突出貢獻，其在2015年鑑定到焦亡的下游效應分子Gasdermin D（GSDMD）【1】，並解析了Gasdermin家族分子的功能【2】。在2017年，邵峰組在Nature報導Caspase-3可以水解Gasdermin E（GSDME）完成非感染性的細胞焦亡，將細胞焦亡的定義改寫【3】。2018年，NCCD將焦亡修正為：一種依賴於Gasdermin家族蛋白形成質膜膜孔的可調控的細胞死亡（Regulated cell death），經常但並不總因炎症性Caspase的活化而完成。隨後，其他課題組也發現Caspase-8也可引起細胞焦亡，並可影響炎症小體功能【4-7】。
關於細胞焦亡的研究進展極大的更新了我們對細胞死亡類型的理解，尤其是那些因時代和技術局限造成的錯誤認知。例如，在腫瘤治療中，我們對化療引起的正常組織損傷往往理解為凋亡，而這實際有很大一部分是由於GSDME活化產生的焦亡。細胞毒性淋巴細胞（如CTL細胞、NK細胞）是免疫系統重要的效應細胞，在識別靶細胞後通過釋放穿孔素（perforin）和其他介質發揮殺傷作用。儘管淋巴細胞的殺傷功能已經有大量免疫學和細胞生物學研究，但目前對靶細胞的死亡類型仍普遍理解為細胞凋亡。
2020年4月17日，邵峰課題組在Science發表題為"Granzyme A from cytotoxic lymphocytes cleaves GSDMB to trigger pyroptosis in target cells"的研究，再次更新了我們對焦亡的理解。他們發現，細胞毒性淋巴細胞（如CTLs，NK細胞等）中的絲氨酸蛋白酶Granzyme A可以經穿孔素（perforin）進入靶細胞，通過水解Gasdermin B（GSDMB）分子Lys229/Lys244位點誘導靶細胞發生焦亡。GSDMB存在組織特異性表達，並在消化系統上皮細胞源腫瘤細胞中呈高表達，而通過GSDMB誘導焦亡將增強抗腫瘤免疫，將成為這些腫瘤治療潛在靶點。
邵峰課題研究人員最先關注是否淋巴細胞引起的細胞死亡具有焦亡特性，通過將NK細胞系（NK-92MI）與外源表達Gasdermin家族蛋白的293T細胞進行共培養，發現在表達了GSDMB的293T細胞較對照組呈現明顯的焦亡特性。這種焦亡不受Pan-Caspase抑制劑zVAD的抑制，但在培養基中添加Ca2+粒子螯合劑EGTA（抑制穿孔素過程）和顆粒酶pan-granzyme抑制劑DCI可以抑制這種死亡。免疫印跡也證實GSDMB被水解為p30和p16兩個片段。
通過表達篩選和體外水解驗證，研究人員發現這種由NK細胞共培養引起的細胞死亡是由穿孔素中顆粒酶granzyme A（GZMA）引起，而其他顆粒酶（granzyme B/H/K/M）均無此效應。研究人員利用Edman測序找到水解位點位於Lys229和Lys244，並再次通過GSDMB K229A/K244A突變體證實以Lys244為主的水解介導了該型焦亡。
隨後一系列敲低實驗和內源實驗等也證實這種細胞死亡類型的具體過程：GZMA經NK細胞釋放的穿孔素進入靶細胞，通過水解靶細胞中GSDMB分子引起焦亡。這種過程極為特異：在顆粒酶中只有GZMA具有激活焦亡功能，而Gasdermin中也只有GSDMB可被GZMA水解。這項發現改寫了焦亡只能經Caspase活化的定論，首次發現Gasdermin可在非Asp位點經絲氨酸蛋白酶GZMA水解執行打孔功能，並將經細胞毒性淋巴細胞誘導的細胞死亡認證為焦亡。
在腫瘤免疫中，CTL細胞可通過釋放穿孔素殺傷腫瘤細胞。研究人員隨後以抗CD19 CAR-T細胞為模型證實，CAR-T細胞可通過GZMA誘導表達GSDMB的CD19+293T細胞發生焦亡。值得一提的是，在今年1月，黃波課題組也證實CAR-T細胞可以引起正常組織通過GSDME引起細胞焦亡，造成CAR-T療法的副作用（詳見BioArt報導：亮點推薦 | CAR-T療法副作用或解決——黃波教授團隊揭示CAR-T療法引起炎症因子風暴的機理）。這些進展也豐富了我們對CAR-T治療效應的認識。
腫瘤免疫中，以PD-1/PD-L1為主的免疫檢查點治療是當前的研究和應用熱點。今年3月，劉志博和邵峰合作在Nature上報導通過誘導腫瘤組織內細胞焦亡可激活T細胞免疫，增強抗腫瘤功能（詳見BioArt報導：Nature背靠背 | 張志斌/劉志博/邵峰等揭示細胞焦亡在腫瘤免疫方面的全新功能）【8】。在上個故事裡，研究人員已經發現，穿孔素可以通過活化Caspase-3和GSDME引起焦亡，但使用Caspase抑制劑並不能完全扭轉死亡表型，暗示也存在其他旁路引起焦亡。邵峰課題組在本研究中填補了這個故事。
通過細胞系篩選，研究人員發現GSDMB在食管癌和胃癌細胞系中存在較高的表達，腫瘤組織中也發現消化系統上皮組織源腫瘤中GSDMB表達較高。TCGA數據中分析也可發現，在膀胱癌、皮膚黑色素瘤和腎透明細胞癌中GSDMB高表達患者預後較好。因小鼠中缺少GSDMB的表達，研究人員在CT26細胞中進行人源GSDMB-WT和K229A/K244A突變體的過表達和成瘤實驗，發現與未過表達組相比，這兩種表達株細胞在體內增殖中並未呈現明顯的差異。但在輔以注射PD-1抗體後，種植了表達GSDMB-WT的小鼠腫瘤體積呈現明顯減少，而K229A/K244A突變體株成瘤則未有明顯變化。該實驗證實，通過拮抗PD-1功能活化T細胞可增強其細胞毒性功能，誘導腫瘤細胞發生GSDMB介導的焦亡，而這種焦亡也進一步通過炎症特性激活了加強版的T細胞免疫。這一部分工作增強了焦亡在腫瘤治療中的可能性。
總結來看，這項工作是邵峰課題組長期在焦亡領域耕耘的又一標誌性成果，改寫了焦亡僅通過Caspase活化的研究定論，在焦亡這一重要的細胞生物學事件中開拓了新的上游通路。邵老師在多次報告中曾提到，細胞死亡類型的並不由上游的切割的蛋白酶決定，而是下游的效應分子。過去近20年的研究只發現並拓展了一類上游蛋白酶（Caspase），這個故事顆粒酶GZMA也拉入焦亡family中。同時，本研究也更新了細胞毒性淋巴細胞誘導靶細胞的死亡類型的陳舊認知。我們可以試想，關於細胞死亡類型不可能只有凋亡和壞死這樣簡單的答案。隨著研究工具和技術的豐富，未來會有更多死亡類型被還原真相。此外，邵峰課題組也在2020年開年的2-4月內先後在Cell、Nature和Science上實現大滿貫（其實想想，大滿貫本身沒什麼實際意義，工作solid，開闢新領域，更新認知才是最重要的）。祝賀邵峰老師，期待邵老師團隊更多的突破性成果。
原文連結：https://science.sciencemag.org/content/early/2020/04/15/science.aaz7548
參考文獻
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2. DING J, WANG K, LIU W, et al. Pore-Forming Activity and Structural Autoinhibition of the Gasdermin Family[J]. Nature, 2016, 535(7610): 111–116. DOI:10.1038/nature18590.
3. WANG Y. Chemotherapy Drugs Induce Pyroptosis through Caspase-3 Cleavage of a Gasdermin[J]. Nature 6;547(7661):99-103: 20. . DOI:10.1038/nature22393
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8. WANG Q. et al.A Bioorthogonal System Reveals Antitumour Immune Function of Pyroptosis. Nature . 2020 Mar;579(7799):421-426. doi: 10.1038/s41586-020-2079-1