本文來源：中華肝臟病雜誌, 2023,31(3) : 322-326.
本文作者：嚴梅梅 孫麗華
摘要：低病毒血症（LLV）是近年來在慢性B型肝炎抗病毒治療領域評價治療應答情況時逐漸被關注的熱點和難點問題。抗病毒治療後存在LLV可能促進耐藥突變、肝纖維化進展甚至肝癌發生。自然狀態下的慢性HBV感染者亦存在LLV，這部分患者是否同樣存在疾病進展風險、風險如何、是否需要儘早抗病毒治療並從抗病毒治療中獲益尚不明確。因此，現對自然狀態下慢性HBV感染者LLV流行情況及其影響進行綜述，為如何全程化管理此部分患者提供參考。
B型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性流行，2018年世界衛生組織估算全球慢性HBV感染者約2.96億；全球每年約有82萬人死於HBV感染相關疾病，其中HBV相關肝硬化和肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的死亡分別占52%和38%。我國肝硬化和HCC患者中，由HBV所致者分別為77%和84%。目前，針對慢性B型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）主要的治療方法是長期抗病毒治療，但有研究表明即使應用恩替卡韋、替諾福韋等一線藥物，部分患者的血清HBV DNA仍持續或間歇性低水平複製，即出現低病毒血症（low level viremia，LLV），核苷（酸）類似物經治後患者的LLV會增加病毒耐藥突變、肝纖維化進展甚至是HCC發生風險，是CHB抗病毒治療領域逐漸被關注的熱點和難點問題。臨床中可見部分未曾抗病毒治療的CHB者也存在持續或間歇性的LLV，其發生情況及臨床結局甚少得到重視，這類患者是否需要納入抗病毒治療亦不明確，本綜述將對自然狀態下LLV的發生、可能的發生機制及其對臨床預後的影響進行總結，從而為臨床擴大CHB抗病毒指征提供參考依據。
一、LLV概述
LLV最早出現在愛滋病治療領域，是指人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染者血漿中持續可測但低於1 000拷貝/ml的病毒載量，Cohen研究表明接受抗病毒治療但出現LLV的HIV感染者中會發生與抗病毒治療相關的耐藥突變，且和病情進展相關。與HIV類似，CHB患者體內病毒也難以徹底清除。隨著檢測技術的快速發展，HBV DNA可檢測到20 IU/ml甚至更低水平，臨床上發現相當比例的CHB患者血清HBV DNA長期維持在低水平，因此，開啟了HBV感染相關LLV的研究。2017年歐洲肝病學會關於HBV感染管理的臨床實踐指南提到低水平病毒血症為HBV DNA < 2 000 IU/ml。2018年美國肝病學會B型肝炎防治指南將LLV定義為在抗病毒治療48周後可檢測到的HBV DNA < 2 000 IU/ml（檢測下限為10 IU/ml）。我國《慢性B型肝炎防治指南（2019年版）》將LLV定義為HBV DNA持續或間歇大於檢測下限但小於2 000 IU/ml。上述指南對於LLV界定的檢測上限病毒量標準一致，但檢測下限標準尚不統一，這種不統一首先源於HBV DNA定量檢測技術的不斷發展，檢測水平和檢測方法的可及性尚難統一；其次對自然狀態下病毒載量低於何種水平、抗病毒治療後達到何種標準才是真正意義的病毒學應答，才能最大限度降低CHB進展風險尚不明確。
近年來，HBV DNA定量檢測多用實時定量PCR-螢光探針的方法，所用商品試劑測得的結果通常以IU/ml標示，單位換算關係通常為1 IU/ml≈5拷貝/ml。LLV的檢測下限取決於HBV DNA定量檢測的靈敏度，臨床上常用HBV DNA檢測技術的檢測值下限有20 IU/ml、100 IU/ml甚或500 IU/ml。陳鵬等的研究顯示受檢人群中LLV患者呈高比例分布，高靈敏度real-time PCR檢測（20/15 IU/ml）的陽性率（48.43%）遠高於常規（100/1 000 IU/ml）檢測（33.40%）。而微滴式數字PCR技術的引進可使HBV DNA定量檢測下限低至8拷貝/ml。因此，為更準確地發現LLV，應採用更加靈敏的檢測方法，並且應對HBV DNA"未檢測到"和"HBV DNA存在但低於檢測下限"兩種結果模式進行區分，後者表示有DNA存在，只是無法準確定量。
二、自然狀態下LLV的發生機制
HBV DNA的複製過程受很多因素影響，而自然狀態下LLV的形成主要跟基因突變和宿主的免疫應答有關。
HBV核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg），是一種結構蛋白，可以組裝成含有HBV基因組的核心顆粒；其中SP1 DNA/RNA、miRNAs、HBV-S區中的G145R和N146Q突變和X-ORF缺失/突變等的表達在HBV複製過程中起負性作用。SP1 DNA/RNA具有剪接DNA作用，封裝剪接RNA轉化為DNA產生缺陷病毒粒子，HBV DNA生成減少。microRNAs（miRNAs）是一類由大約22個核苷酸組成的小型非編碼RNA，Hao等在隱匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）患者中發現32個差異表達的miRNAs，可以下調HBV基因表達和複製，抑制HBV DNA的表達和轉錄，在低病毒載量的OBI中發揮關鍵作用。G145R是"a"決定簇中的一種經典免疫逃逸突變，有報導HBV-S區中的G145R和N146Q突變使糖基化位點喪失，導致病毒粒子分泌受損，降低了B型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）的抗原性、削弱了HBsAg或病毒顆粒的分泌能力、顯著降低了血清HBV DNA水平。X-ORF（X區）編碼一種名為HBX（X蛋白）的154aa蛋白，涉及S-啟動子的激活，它的不完整也會導致HBV DNA複製水平的下降，並導致病毒蛋白的產生不足。
除此之外，人體肝細胞在感染HBV後可發生炎症性損傷，並產生損傷後的代償性增殖。由於感染肝細胞內以游離形式存在的共價閉合環狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）缺乏染色體特有的著絲粒，因此，其在細胞有絲分裂過程中難以有效進入子代細胞新形成的細胞核內，進一步導致子代cccDNA的丟失和cccDNA池的稀釋，Wong等研究表明感染了HBV的人源代肝細胞在快速代償性增殖時，包括cccDNA拷貝數在內的所有病毒學指標表達均快速下降。OBI患者的HBV特異性T淋巴細胞反應與既往HBV感染恢復者相當，免疫反應可以將病毒複製抑制到低水平，也可以將HBsAg的表達抑制到無法檢測的水平，Zerbini等認為HBV主要局限於肝臟並且僅有短暫LLV的原因是免疫反應控制了HBV複製，免疫系統通過成熟的保護性記憶T淋巴細胞來有效控制感染。研究顯示，CHB患者的血清Th1及Th2類細胞因子均顯著高於健康同齡者，且其病毒載量越高，Th1及Th2類細胞因子含量越多。體液免疫反應對宿主免疫也很重要，B淋巴細胞產生中和抗體，同時可能在抑制HBV複製方面發揮作用，如果宿主對HBV的免疫應答被抑制，則會出現HBV重新激活的現象。
三、自然狀態下LLV的流行
目前，慢性HBV感染的自然病程分為4期，自然狀態下HBV相關LLV可見於多種臨床類型的慢性HBV感染者中，包含非活動性HBsAg攜帶狀態、B型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）陰性的CHB、OBI及一部分HBV相關肝硬化、HCC和肝衰竭患者；此外，在一些"不確定期"患者和"HBV再激活"患者亦存在較多LLV。由於以往的研究側重活動性或高病毒水平CHB患者的防治，臨床缺乏專門針對LLV大規模的流行病學調查，但在以往關於病毒複製水平與CHB疾病嚴重程度的相關研究中可提供有關自然狀態下LLV的流行情況和危害的數據。
1．非活動性HBsAg攜帶狀態：
該期患者的HBV DNA水平均< 2 000 IU/ml，丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）/天冬氨酸轉氨酶水平正常，HBsAg < 1 000 IU/ml，均屬於LLV。Bonacci等報導在287例HBeAg陰性、HBV DNA≤20 000 IU/ml、ALT≤80 U/L的患者中，47.7%處於LLV，屬於非活動期；52.3%屬於不確定期，而不確定期患者中有21.0%出現LLV。
2．"不確定期"的LLV：
該期是指初治慢性HBV感染者隨訪1年，其HBV DNA和ALT模式不同於慢性HBV感染4個傳統分期，HBV DNA或ALT水平介於非活動性攜帶者和HBeAg陰性的CHB之間的"灰區"。Duan等在對327例HBsAg陽性、HBeAg陰性、ALT正常患者隨訪中發現221例患者出現LLV，其中51.6%處於不確定期，均出現肝組織學≥G2/F2；48.4%處於非活動期。221例中有60例出現肝組織學≥G2，102例出現肝組織學≥F2。
3．OBI中的LLV：
OBI表現為血清HBsAg陰性，但血清和肝組織中HBV DNA陽性。其肝臟中存在具有複製能力的HBV DNA，血液中存在或沒有HBV DNA。Xia等對698例HCC與慢性HBV感染相關的研究結果顯示，138例HBV相關HCC患者為OBI，其中97.8%（135/138）的患者HBV DNA < 1 000 IU/ml，同時這138例中72.5%發現腫瘤直徑> 5.0 cm，伴有肝內和/或肝外轉移。
四、自然狀態下LLV的危害
1．LLV患者存在顯著肝纖維化：
目前，有研究結果顯示即使HBV DNA水平較低，肝組織學病變及顯著肝纖維化的發生率也相當高。Papatheodoridis等研究的399例HBeAg陰性、2×正常值上限（upper limit of normal，ULN）> ALT > 1×ULN、HBV DNA陽性患者中，42例LLV患者中83%發生肝組織學變化，其中62.0%至少有中度纖維化（2期）。Yenilmez等報導273例年輕男性CHB患者中，139例LLV患者有顯著炎症性壞死（組織活動指數≥4）和顯著肝纖維化（Ishak評分≥2）發生率分別為44.6%和30.2%。同時，也有研究證明非活動性HBsAg攜帶並不意味肝臟損害真正處於非活動狀態，而是僅僅說明病毒處於短暫的抑制狀態，Wang等報導102例非活動性CHB患者中，顯著肝組織學損害的比例高達38.2%，包括22.5%的Metavir評分2~3級的肝纖維化和24.5%的中重度炎症。
2．LLV患者仍可發生肝硬化及其相關併發症：
低風險的HBV攜帶者通常是指LLV狀態和ALT水平持續正常的患者，但其也可能突然出現病毒複製活躍、肝臟炎症反應甚至嚴重肝損傷的情況。Cho等在1 118例CHB患者隨訪中，373例非活動性HBsAg攜帶患者中17.4%出現肝硬化；中位隨訪時間7個月，10例發生死亡；隨訪第5年，HCC的累積發生率為2.4%。HBeAg持續陰性或保持低水平HBV DNA複製的CHB患者中，肝臟炎症反應較輕，但病毒在體內的複製並未停止，病情仍在進展，肝硬化程度逐漸增加。一項中位隨訪時間為11年的REVEAL研究在3 582例CHB患者中顯示，2 019例HBeAg陰性LLV患者中869例HBV DNA < 60 IU/ml、1 150例HBV DNA < 2 000 IU/ml，肝硬化的累積發生率分別為4.5%、5.9%。
在肝硬化患者中，雖然血清HBV DNA水平低，但其仍可繼續損害肝細胞、促進肝臟炎症，一旦形成重度肝纖維化甚至肝硬化，門靜脈高壓會持續進展，即使HBV DNA已轉陰、HBsAg消失，仍具有很高的併發症發生率，甚至進展至HCC。皇旭等研究發現481例HBV-LLV相關肝硬化患者的總體肝硬化併發症發生率為80.04%，包括脾功能亢進（58.8%）、食管胃底靜脈曲張（55.5%）、腹水（42.0%）、食管胃底靜脈曲張破裂出血（12.3%）、門靜脈血栓（6.0%）、肝性腦病（3.5%）、HCC（1.3%）；即便是341例（70.9%）HBV DNA陰性患者和95例（19.8%）HBsAg陰性患者，其併發症發生率也分別有82.70%、85.26%。Lee等在中位隨訪時間為71.9個月對567例HBV-LLV相關代償期肝硬化患者隨訪中發現，10.2%和9.5%分別發展為HCC和肝硬化併發症，6.3%死亡。
3．LLV患者仍可發生HCC：
在HBV相關的HCC患者中，儘管血清病毒水平較低，但持續性HBV感染仍可能是導致腫瘤復發和肝功能異常的重要因素，未經有效抗病毒治療的LLV是HCC復發的危險因素。鄧德麗等在99例HBeAg陰性HBV-LLV患者研究中，59.0%患者存在明顯肝組織損傷（G≥2/S≥2）；隨訪4.5年後，23例二次肝活檢，未治的10例肝組織學有進展，明顯肝組織損傷比例從50.0%上升至90.0%，經治（抗病毒）的13例肝組織學有改善，明顯肝組織損傷從61.5%下降至46.2%。隨訪5年，21例未治患者HCC累積發生率為16.9%（14/83），62例經治患者HCC累積發生率為3.6%（3/83）。Sun等在212例HCC患者隨訪中發現104例LLV患者中75.0%合併有肝硬化，中位隨訪時間13.5個月，40.4%患者腫瘤復發。
4．LLV患者仍可發生再活動：
非活動性的CHB患者可自發或在一定條件下發生HBV再活動。Zhou等研究顯示中位隨訪時間4年HBeAg陰性、HBV DNA≤10 000 IU/ml的970例CHB患者中，ALT≤2×ULN且基線HBV DNA≤2 000 IU/ml的有634例，其中HBV DNA≤100 IU/ml和101 IU/ml~≤2 000 IU/ml的轉為活動性肝炎的5年累積發生率分別為9.7%和15.9%。同時一些研究也表明，血清HBV DNA水平較低的HCC患者接受手術、肝動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization TACE）後病毒重新被激活，抗病毒治療產生了短期生存益處，特別是對於早期HCC患者。Sohn等研究在對130例接受根治性切除治療的早期HBV-LLV相關HCC患者隨訪中，有64例在術前接受抗病毒治療，術前HBV DNA陰性（< 9 IU/ml）組53例，LLV組77例；術後隨訪28.3個月，130例患者中有53例（40.8%）在術後HBV再激活。兩組患者HBV再激活率分別為41.5%（22/53）和40.3%（31/77），130例術後1、2、3年的HCC累積復發率分別為17.0%、23.3%和31.4%。Shao等的研究顯示109例HBV-LLV相關HCC患者行TACE術後共有21.1%出現HBV再激活。
自然狀態下LLV的發生率及其轉歸總結見表1。
表1 自然狀態下LLV的發生率及其轉歸
五、小結
綜上所述，自然狀態下慢性HBV感染者中存在的LLV人數不能忽視，隨著檢查技術水平的提高和普及，這個比例還會升高。持續LLV可緩慢進展至肝纖維化和肝硬化，甚至HBV再激活導致HCC發生，因此，LLV並不完全意味著低活動、低風險，無病毒血症也並不完全對應疾病無活動、無進展風險。已有較多研究顯示對抗病毒治療後LLV積極調整治療方案後可減緩疾病進展，而最新發布的《擴大慢性B型肝炎抗病毒治療的專家意見》中也已提出應積極治療有疾病進展風險的"不確定期"慢性HBV感染者。自然狀態下的LLV患者是否儘早接受抗病毒治療、治療時機如何判斷和選擇、治療獲益如何等問題值得進一步研究。