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子宮內膜損傷引起的宮內粘連（IUA）是女性不孕的主要原因之一。目前子宮內膜損傷提供的臨床益處有限，不能改善子宮內膜容受性和妊娠結局。組織工程和再生醫學被認為是解決這一問題的潛在解決方案，並可能為受傷的人子宮內膜再生提供有效的方法。
近日，來自重慶大學的馮茜、中國科學院重慶綠色智能技術研究院的於永生聯合同濟大學的周倩團隊製備了一種基於氧化透明質酸（HA-CHO）和醯肼接枝明膠（Gel-ADH）的可注射水凝膠。hUCMSCs負載的注射水凝膠治療顯著降低了子宮內膜纖維化，降低了促炎因子（IL-1β和IL-6）的表達，增加了抗炎因子（IL-10）的表達。這項研究表明，加載hUCMSCs的可注射水凝膠具有促進子宮內膜損傷快速恢復的有效治療策略的潛力，並且這種水凝膠是再生醫學應用的有前途的生物材料。
相關論文「Functionalized Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells and Injectable HA/Gel Hydrogel Synergy in Endometrial Repair and Fertility Recovery」於2023年6月17日在線發表於雜誌《Acta Biomaterialia》上。
1. HA/Gel水凝膠的微觀結構和流變特性
首先，研究者將HA-Gel水凝膠中Gel-ADH的最終濃度固定為16 wt%，HA-CHO的濃度調整為4 wt%，6 wt%，8 wt%和10 wt%。HA/Gel水凝膠的快速凝膠是由於HA-CHO的醛基和Gel-ADH的醯肼基團之間的快速希夫鹼反應。SEM圖像（圖1A）清楚地顯示了不同HA-CHO濃度的HA/Gel水凝膠的連接微孔結構，這些微孔使封裝的hUCMSC和周圍培養基之間能夠緩慢交換細胞分泌因子和培養基營養物質。如圖1B所示，隨著HA-CHO濃度從4%增加到8%，模量值呈增加趨勢，代表了交聯鍵的強度。此外，6%HA-CHO濃度的水凝膠的失效點約為120%應變（圖1C）。剪切稀化試驗表明HA/Gel水凝膠基質的「凝膠」狀態穩定（圖1D）。
2. HA/Gel水凝膠的溶脹性、降解性、自修復性和粘附性
然後，作者進一步測試了HA/Gel水凝膠的溶脹和降解性能。所有水凝膠基團在PBS中孵育12小時後達到溶脹平衡（圖2A）。溶脹率降低（圖2A）和降解比（圖2B）隨著HA-CHO濃度的增加而增加。由於水凝膠的穩定性和滲透性對於水凝膠在子宮內膜修復中的應用都很重要，研究者選擇了6%HA/Gel水凝膠進行以下實驗。注射到T型和J型模具中後調整水凝膠的形狀，並且自修復水凝膠在被提起後沒有破裂（圖2C）。將水凝膠離體注射到大鼠子宮中，發現水凝膠沒有從穿刺的子宮中泄漏出來。解剖子宮後，發現水凝膠附著在子宮壁上，當子宮彎曲和扭曲時沒有脫落（圖2D）。水凝膠中HA-CHO的醛基可以與大鼠子宮組織中的氨基反應。這種反應促進與大鼠子宮的粘附。
3. hUCMSC的分離、鑑定和傳代選擇
之後，研究者從人臍帶組織中分離hUCMSCs並培養。蛋白質印跡分析顯示，在hUCMSC的前4代中，Oct-2，Nanog和Sox2的蛋白質表達水平沒有明顯差異（圖3A-D）。將hUCMSC的前5代封裝在水凝膠中，通過ELISA測定法評估生長因子分泌（圖3E-H），通過CCK8測定評估細胞增殖（圖3I），並通過Transwell測定法確定細胞遷移（圖3J，L）。結果顯示，hUCMSCs前5代的生長因子分泌，細胞增殖和遷移沒有顯著差異（圖3E-J，L）。最終，選擇第四代hUCMSC進行後續實驗。
4. HA/Gel水凝膠對hUCMSC的影響
然後，探索了HA/Gel水凝膠對細胞增殖和遷移的影響，CCK-8測定表明，HA/Gel水凝膠具有促進hUCMSCs增殖的能力（圖3M）。這一結果可能是由於水凝膠的多孔性允許hUCMSC和培養基之間的營養交換以及水凝膠的三維結構提供了更寬的生存空間（圖3N）。Transwell測定表明，在12 h和24 h內，水凝膠/hUCMSCs組的遷移細胞比hUCMSCs組顯著減少（圖3O-Q）。體內成像顯示，DiR標記的hUCMSCs主要積聚在子宮中，在其他組織中未觀察到（圖4），表明hUCMSCs局部治療的安全性。
5. 不同干預後子宮內膜厚度、腺體和血管的評估
然後，研究者通過機械抓撓構建了子宮內膜損傷的大鼠模型。經過三個發情周期的治療後，水凝膠/hUCMSCs組中的子宮內膜厚度，腺體數量和血管恢復到基線。雖然單獨水凝膠治療或單獨hUCMSCs治療恢復了子宮內膜厚度，腺體數量和血管數，但上述兩組的子宮內膜恢復弱於假手術組和水凝膠/hUCMSCs組。與單獨使用水凝膠和單獨使用hUCMSCs相比，水凝膠/hUCMSCs聯合治療在促進子宮內膜修複方面更有效（圖5）。
6. 子宮內膜再生的機制
從組織學角度來看，水凝膠聯合hUCMSCs治療可有效修復受損子宮內膜。因此，研究者研究了子宮內膜修復的機制。結果表明，模型組4種蛋白（ki67、vimentin、ER和VEGF）的表達水平顯著低於假蛋白組，提示4種蛋白的功能與子宮內膜損傷密切相關（圖6A-C；圖7A）。此外，水凝膠/hUCMSCs組合組中Ki67的表達顯著高於模型組，表明子宮內膜厚度的恢復可能是子宮內膜基質細胞快速增殖的原因，補償了受損的子宮內膜細胞（圖6A，D）。水凝膠/hUCMSCs組中vimentin，ER和VEGF的表達水平顯著高於模型組（圖6B，C，E，F；圖7A-B）。
為了進一步研究損傷子宮內膜中VEGF表達增加的分子機制，研究者檢查了不同干預下大鼠子宮內膜中的蛋白表達水平（圖7C）。水凝膠組與模型組p-MEK和p-ERK1/2表達水平差異無統計學意義，但水凝膠組VEGF蛋白表達水平顯著高於模型組（圖7C-G），這意味著單獨治療hUCMSCs可能通過MEK/ERK1/2途徑誘導損傷子宮內膜中的VEGF表達，HA/Gel水凝膠可以進一步增強這種效果。
此外，研究者從不同治療組的受傷子宮內膜中提取mRNA，並檢查IL-1β，IL-6和IL-10的表達水平（圖8A-C）。在模型組中，促炎因子IL-1β和IL-6的表達水平顯著升高，抗炎因子IL-10的表達水平與假手術組相比顯著降低，表明機械損傷引起了嚴重的炎症。水凝膠聯合hUCMSCs治療更顯著地解決了受傷子宮內膜的炎症環境。
最後，研究者探討了水凝膠/hUCMSCs聯合治療是否恢復了子宮內膜損傷模型中大鼠的生育能力，表明HA/Gel水凝膠治療不會導致胎兒或胎盤畸形（圖8D-E）。安全性評估表明，HA/Gel水凝膠和hUCMSCs對活產、幼崽的早期發育以及母鼠的腎和肝功能無害（圖8F-L）。
綜上，本文製備了一種基於氧化透明質酸（HA-CHO）和醯肼接枝明膠（Gel-ADH）的可注射水凝膠。HA/Gel水凝膠與hUCMSCs聯合治療可有效改善子宮內膜損傷大鼠模型中損傷子宮內膜的再生。水凝膠/hUCMSCs聯合治療減少了受傷子宮內膜的纖維化，增加了子宮內膜的厚度，增加了血管和腺體的數量，並通過MEK/ERK1/2信號通路誘導子宮內膜VEGF的表達。此外，水凝膠/hUCMSCs聯合治療在子宮內膜損傷大鼠模型中成功恢復了胚胎植入和妊娠維持，並對母鼠和胎兒都表現出足夠的安全性。因此，HA/Gel水凝膠和hUCMSCs的聯合治療可能為患有IUA的患者帶來有希望的策略。
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